本文關鍵詞：質膜蛋白3參與的真菌耐多烯類AmB機制研究　出處：《東華大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： AmB 耐藥性 PMP3 ROS MAPK途徑

【摘要】：深部真菌感染是一種致病性真菌侵犯皮下組織和器官所引起的真菌感染性疾病,其死亡率較高且難以治療。兩性霉素B(Amphotericin B,AmB)是一種有效治療深部真菌感染的臨床用藥,但隨著AmB使用的增多,耐藥性問題日漸嚴峻,而且耐藥菌株的分子機制并不清楚。本實驗室前期研究表明質膜蛋白3(PMP3p)高表達增加了細胞對AmB的抗性,但PMP3與AmB相關性的研究還很少。本文開展質膜蛋白3在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Canidia Albicans)中參與的耐AmB機制研究。文獻研究表明AmB的作用機制主要有兩種:一種是通過與甾醇結合,使細胞質膜形成孔洞,胞內物質外流,造成細胞死亡;一種是AmB能增加細胞內的氧化損傷,造成細胞死亡。因此,首先,本文通過PI染色質完整性檢測實驗和羅丹明123吸收和外排實驗,發(fā)現過表達PMP3能增加細胞質膜的穩(wěn)定性。因PMP3,最早是在植物中發(fā)現的,且對植物細胞內離子的平衡有重要作用。因此我們探究了在酵母中,PMP3調控兩性霉素B抗性與離子的關系。實驗表明PMP3對Na+的平衡起重要作用,而與K+和Ca2+沒有相關性。同時還發(fā)現,PMP3調節(jié)AmB的抗性與NHA1和VCX1通路是無關的。其次,我們在甾醇合成通路阻斷的突變體(erg2△,erg6△,erg24△,hmg1△和hmg2△)中超表達PMP3基因也能夠提高細胞對AmB的抗性,說明阻斷甾醇合成通路并不影響PMP3調節(jié)細胞對AmB的抗性。進一步研究在野生型(BY4741)及不同遺傳突變菌株中過表達PMP3甾醇含量沒有顯著變化。這表明PMP3不是通過調控甾醇的合成來影響細胞對AmB的抗性。最后,研究了PMP3與藥物誘導的氧化脅迫之間的關系。結果表明AmB能造成細胞內活性氧的增加,使細胞內的脂質過氧化產物(TBRAS)和蛋白羰基含量(CP)增加。并且抗氧化相關的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)活性也增加,超表達PMP3能使細胞內抗氧化酶合成升高,降低了細胞內的活性氧含量,從而保護了細胞,這表明超表達PMP3能提高細胞內抗氧化酶降低胞內活性氧來增加細胞對AmB的抗性。同時,已有研究表明細胞內ROS的降低不僅與抗氧化酶有關,而且與MAPK通路有密切的關系。我們進一步研究表明,MAPK通路的中的關鍵基因SPC1和ATF1缺失的情況下(atf1△和spc1△),超表達PMP3不表現AmB抗性,也不能降低細胞內活性氧;PT-PCR的檢測細胞PMP3表達水平與AmB處理或氧化脅迫的依賴關系被破壞�？傊�,PMP3調節(jié)AmB的抗性依賴于MAPK通路的完整性。
[Abstract]:Deep fungal infection is a fungal infectious disease caused by pathogenic fungi invading subcutaneous tissues and organs, and its mortality is high and difficult to treat. Amb is an effective clinical drug for the treatment of deep fungal infections, but with the increasing use of AmB, the problem of drug resistance is becoming more and more serious. In addition, the molecular mechanism of drug-resistant strains is not clear. Our previous study showed that the high expression of plasma membrane protein 3PMP3p increased the cell resistance to AmB. However, the correlation between PMP3 and AmB was seldom studied. In this paper, the plasma membrane protein 3 was developed in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans (Candida albicans). Canidia Albicanss is involved in the mechanism of AmB tolerance. The literature shows that there are two main mechanisms of AmB: one is by binding with sterols. Make the cell plasma membrane to form a hole, intracellular material outflow, resulting in cell death; One is that AmB can increase the oxidative damage in cells and cause cell death. Therefore, firstly, the Pi chromatin integrity test and Rhodamine 123 absorption and efflux test were used. It was found that overexpression of PMP3 could increase the stability of cytoplasmic membrane. PMP3 was first found in plants and played an important role in the homeostasis of intracellular ions in plants. PMP3 regulates the relationship between amphotericin B resistance and ions. The results show that PMP3 plays an important role in Na balance, but has no correlation with K and Ca2. The resistance of PMP3 to AmB regulation was not related to the NHA1 and VCX1 pathway. Secondly, our mutant Erg2 / erg6 / Erg24 was blocked by sterol synthesis pathway. Overexpression of PMP3 gene in hmg1 and hmg2 can also enhance the cell resistance to AmB. It is suggested that blocking the sterol synthesis pathway does not affect the resistance of PMP3 to AmB. There was no significant change in the content of overexpressed PMP3 sterols in different genetic mutants, which indicated that PMP3 did not affect the resistance of cells to AmB by regulating the synthesis of sterols. The relationship between PMP3 and drug-induced oxidative stress was studied. The results showed that AmB could increase intracellular reactive oxygen species (Ros). The lipid peroxidation products (TBRAS) and protein carbonyl content (CPP) were increased, and antioxidant related enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (catalase). Glutathione peroxidase (GPX) activity was also increased. Overexpression of PMP3 could increase the synthesis of antioxidant enzymes and decrease the content of reactive oxygen species in the cells, thus protecting the cells. This suggests that overexpression of PMP3 can increase intracellular antioxidant enzymes and decrease intracellular reactive oxygen species (Ros) to increase cell resistance to AmB. Meanwhile, studies have shown that the decrease of intracellular ROS is not only related to antioxidant enzymes. Our further study shows that the key genes in the MAPK pathway SPC1 and ATF1 are absent in the presence of ATF1 and spc1). Overexpression of PMP3 did not show AmB resistance, nor did it reduce intracellular reactive oxygen species (Ros). The relationship between the PMP3 expression level of PT-PCR and AmB treatment or oxidative stress was destroyed. In a word, the regulation of AmB resistance by PMP3 depended on the integrity of MAPK pathway.
【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R379

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本文編號：1404146