本文關鍵詞：嘌呤受體P2X7和P2Y2在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨和成脂分化中的作用　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 嘌呤受體 骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨分化 成脂分化

【摘要】：目的探討嘌呤受體P2X7和P2Y2在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨和成脂分化中的作用。方法1.體外實驗(1)受體表達檢測：免疫熒光染色檢測BMSCs上嘌呤受體P2X7和P2Y2的表達,RT-qPCR及Western-blot檢測受體表達與細胞分化狀態(tài)的關系；(2)細胞增殖及活性檢測：CCK-8試劑盒檢測激活嘌呤受體P2X7和P2Y2對BMSCs增殖及細胞活性的影響；(3)成骨分化檢測：RT-qPCR及Western-blot檢測成骨指標(RUNX2,ALP及OPN)的表達；茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)形成；ALP(堿性磷酸酶)染色檢測ALP生成：(4)成脂分化檢測：RT-qPCR及Western-blot檢測成脂指標(PPARy,FABP4及Adipsin)的表達；油紅O染色檢測脂滴生成；(5)基因沉默技術：siRNA分別沉默P2X7和P2Y2受體,檢測嘌呤受體P2X7和P2Y2在BMSCs成骨和成脂分化中的作用；(6)信號通路檢測：Western-blot檢測激活嘌呤受體P2X7和P2Y2后其下游被激活的信號通路。2.體內(nèi)實驗(1)動物模型：用小鼠卵巢切除骨質(zhì)疏松模型研究在體內(nèi)激活嘌呤受體P2X7后對松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨及髓腔內(nèi)脂肪生成的影響；(2)組織形態(tài)學分析：microCT檢測松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨參數(shù)；HE染色檢測松質(zhì)骨骨參數(shù)和髓腔內(nèi)脂滴形成。結(jié)果1.SD大鼠BMSCs上表達嘌呤受體P2X7和P2Y2;在成骨分化過程中P2Y2受體表達逐漸減少,而P2X7受體表達逐漸增加；在成脂分化過程中P2Y2受體表達逐漸增多,而P2X7受體表達逐漸減少。2. BzATP通過激活P2X7受體促進BMSCs成骨指標表達、ALP生成及鈣結(jié)節(jié)形成,抑制成脂指標表達及脂滴的形成。P2X7受體的siRNA和特異性拮抗劑(BBG)完全阻止了BzATP的作用。microCT顯示BzATP可以減少因卵巢切除所致的松質(zhì)骨丟失,但對皮質(zhì)骨的參數(shù)沒有影響；HE染色顯示BzATP可以增加卵巢切除小鼠的松質(zhì)骨數(shù)目和體積,使骨髓腔內(nèi)脂滴生成減少。3. BzATP刺激使ERK1/2和JNK磷酸化增加,BBG抑制BzATP誘導的ERK1/2和JNK的磷酸化；阻滯ERK1/2和JNK信號通路后,BzATP對BMSCs成骨和成脂基因表達的影響消失。4.UTP(三磷酸尿苷)通過激活P2Y2受體抑制BMSCs成骨指標表達、ALP生成及鈣結(jié)節(jié)形成,促進BMSCs成脂指標表達及脂滴的形成。5.UTP刺激使ERK1/2磷酸化增加,P2Y2受體siRNA抑制UTP誘導的ERK1/2磷酸化；阻滯ERK1/2信號通路24h后,UTP對BMSCs成骨和成脂基因表達的影響消失。結(jié)論1. BzATP通過P2X7受體激活ERK1/2和JNK信號通路,促進大鼠BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化；BzATP可以減少小鼠卵巢切除導致的松質(zhì)骨丟失。2.UTP通過激活P2Y2受體促進大鼠BMSCs成脂分化、抑制其成骨分化；ERK1/2信號通路介導這個過程的起始階段。
[Abstract]:Objective to investigate the purine receptor P2X7 and P2Y2 in rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) osteogenic and adipogenic differentiation effect in vitro. Methods 1. (1) receptor expression detection: immunofluorescence staining to detect the expression of BMSCs purinergic receptors P2X7 and P2Y2, the relationship between RT-qPCR and Western-blot receptor expression detection and differentiation the state of cells; (2) to detect cell viability and proliferation: CCK-8 kit to detect the activation effect of purine receptor P2X7 and P2Y2 on BMSCs cell proliferation and cell activity; (3) the osteogenic differentiation of RT-qPCR and Western-blot detection: detection of osteogenic index (RUNX2, ALP and OPN) expression; alizarin red staining and calcium nodules; ALP (alkaline phosphatase) staining ALP generation: (4) adipogenic differentiation test: RT-qPCR and Western-blot detection into fat index (PPARy, FABP4 and Adipsin) expression; oil red O staining, lipid droplet formation; (5) gene silencing Technology: Si RNA silencing P2X7 and P2Y2 receptor, P2X7 receptor and P2Y2 in detection of BMSCs osteogenic and adipogenic differentiation; (6) signal pathway detection:.2. pathway in vivo detection of Western-blot activation of the purinergic receptor P2X7 and its downstream P2Y2 is activated (1) animal model: resection of the osteoporosis model of activation purine receptor P2X7 in vivo after cancellous bone in mouse ovary, the influence of the cortical bone and intramedullary adipose tissue morphological analysis; (2): microCT detection of cortical and trabecular bone parameters; HE staining cancellous bone marrow cavity parameters and lipid droplet formation. The results of BMSCs 1.SD rats on expression of purine expression of P2X7 and P2Y2; decreased in expression of P2Y2 receptor in bone differentiation, and the expression of P2X7 receptor increased gradually; gradually increase in expression of P2Y2 receptor in adipogenic differentiation process, and gradually reduce the expression of P2X7 receptor.2. BzATP Through the activation of the P2X7 receptor to promote BMSCs osteogenic index expression, ALP formation and formation of calcium nodules, inhibit the formation of.P2X7 receptor antagonist siRNA and lipid index and expression of lipid droplets (BBG) completely blocked the effect of.MicroCT BzATP shows that BzATP can reduce the loss due to ovariectomy induced cancellous bone, but no influence of parameters on the cortical bone; HE staining showed that BzATP can increase the ovariectomized mice cancellous bone marrow cavity number and volume, the accumulation of lipid droplets decreased.3. BzATP stimulated ERK1/2 and JNK phosphorylation increased, BBG inhibited BzATP induced ERK1/2 and JNK phosphorylation; block ERK1/2 and JNK signaling pathway, BzATP BMSCs osteogenic and adipogenic gene expression of.4.UTP disappeared (three triphosphate) through the activation of the P2Y2 receptor inhibits BMSCs expression of osteoblast index, ALP generation and formation of calcium nodules, promote BMSCs expression and lipid index of lipid droplet shape .5.UTP stimulation increased phosphorylation of ERK1/2, P2Y2 receptor siRNA inhibits ERK1/2 induced UTP phosphorylation; block ERK1/2 signaling pathway after 24h, UTP of BMSCs osteogenic and adipogenic gene expression disappeared. Conclusion 1. BzATP through activation of P2X7 receptors ERK1/2 and JNK signaling pathway promotes rat osteogenic differentiation of BMSCs, inhibit the adipogenic differentiation; BzATP mice can reduce the OVX induced cancellous bone loss.2.UTP by activation of P2Y2 receptor promotes rat BMSCs adipogenic differentiation, inhibit their osteogenic differentiation; the initial stage of ERK1/2 signaling pathway mediated by this process.

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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