本文關(guān)鍵詞：H7N9亞型流感病毒樣顆粒免疫原制備與精制免疫球蛋白研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：H7N9亞型流感病毒是一種新發(fā)流感病毒,于2013年3月在上海和安徽兩地首次發(fā)現(xiàn),截止到2017年2月22日,全球共報(bào)道1230例H7N9亞型流感病毒感染人的病例,其中428例死亡,死亡率達(dá)到34.80%。目前,多個國家已經(jīng)著手開展H7N9亞型流感病毒病診斷、防治等相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)工作。對于高風(fēng)險(xiǎn)人群,接種疫苗是一種有效的預(yù)防手段;對于易感人群和感染患者,被動免疫則是一種有效的緊急預(yù)防和治療手段。因此,有必要研制安全、有效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的流感疫苗和治療抗體。流感病毒的致病性主要受到病毒的分子特性和宿主的種屬差異影響,構(gòu)建流感病毒動物感染模型,開展病毒的致病性分子機(jī)制研究,將有助于我們有針對性地對該病進(jìn)行免疫預(yù)防和治療研究。Palladino等用中和單抗治療免疫缺陷的A型流感病毒感染小鼠,顯示出良好的治療效果,提示抗體療法可能成為未來對抗H7N9亞型流感有效的手段之一。人源抗體是最理想的治療抗體,但是短期難以獲得大量的人源血清,因此異源抗體(動物源免疫球蛋白)成為現(xiàn)階段必然的抗體治療替代手段之一。在各種動物中,馬抗血清制品生產(chǎn)和應(yīng)用已有100多年的歷史,具有易于大規(guī)模制備、特異性好、制備周期相對較短等優(yōu)點(diǎn),在應(yīng)對傳統(tǒng)疾病和新發(fā)/突發(fā)傳染病中發(fā)揮了巨大作用。本研究以研制馬抗H7N9亞型流感精制免疫球蛋白為研究目標(biāo),首先建立了H7N9亞型流感病毒小鼠感染模型,為H7N9流感治療性抗體研究提供了評價平臺;其次,利用昆蟲細(xì)胞—桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),包裝出含有A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株HA、NA和M1蛋白的病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs),并對VLPs進(jìn)行體外生物學(xué)活性檢測和小鼠體內(nèi)免疫原性研究;最后,以VLPs作為免疫原免疫馬匹,通過優(yōu)化生產(chǎn)工藝對馬高免血清進(jìn)一步精制,獲得了馬抗H7N9亞型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab′)2,并評價其預(yù)防和治療效果。1、H7N9亞型流感病毒小鼠感染模型的構(gòu)建及致病性分子基礎(chǔ)研究選取BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物模型,將A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株通過鼠肺連續(xù)傳代獲得鼠適應(yīng)株P(guān)10M1、P10M2和P10M3。通過小鼠半數(shù)致死量、病死率、病毒復(fù)制效率、組織嗜性等評價指標(biāo),成功建立了H7N9亞型流感病毒小鼠感染模型,為H7N9亞型流感治療藥物和疫苗預(yù)防效果評價建立了平臺�；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn),PA、HA、NA、M和NP基因上的若干個位點(diǎn)發(fā)生變異,推測發(fā)現(xiàn)其中PA-T97I可能是H7N9亞型流感病毒對哺乳動物致病性增強(qiáng)的分子基礎(chǔ)之一。2、H7N9亞型流感病毒樣顆粒制備利用昆蟲細(xì)胞——桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了表達(dá)A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株HA、NA和M1的重組桿狀病毒,經(jīng)PCR、間接免疫熒光和Western blot鑒定,目的蛋白獲得成功表達(dá)。將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后成功組裝成H7N9亞型流感病毒樣顆粒在透射電鏡下可觀察到球形、直徑約100nm、表面有典型纖突的流感VLPs,血凝效價為1:27~1:28。將VLPs通過肌肉注射或滴鼻方式,免疫BALB/c小鼠10μg VLPs/只,二免后兩周,在H7N9亞型流感病毒小鼠適應(yīng)株10MLD50劑量的攻擊下,可以對小鼠提供100%的免疫保護(hù)。因此,所制備的H7N9亞型流感VLPs具有很好的免疫原性,為H7N9亞型流感免疫球蛋白的免疫原制備奠定了基礎(chǔ)。3、H7N9亞型流感病毒精制免疫球蛋白研究以VLPs制備免疫原免疫馬匹,五免后獲得HI抗體效價為1:10240的高免血清。利用已構(gòu)建的H7N9亞型流感病毒小鼠感染模型,用10個MLD50采用滴鼻方式進(jìn)行攻毒,攻毒前36h、攻毒后24h,各組小鼠分別腹腔注射0.2ml高免血清,小鼠的存活率均達(dá)100%,而對照組全部死亡。由此證明,制備的馬抗H7N9亞型流感病毒高免血清對該亞型流感病毒感染具有良好的緊急預(yù)防和治療效果。在傳統(tǒng)馬抗血清純化工藝的基礎(chǔ)上,對制備工藝進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化,采用酶切純化工藝去除抗體的Fc片段,親和柱層析方法純化免疫球蛋白F(ab′)2。經(jīng)SDS-PAGE、薄層掃描,結(jié)果表明,所獲得的精制免疫球蛋白F(ab′)2的純度在93%以上。采用固定病毒—稀釋免疫球蛋白方法,測得的中和抗體效價為1:5120。利用已構(gòu)建的H7N9亞型流感病毒小鼠感染模型,用10個MLD50采用滴鼻方式進(jìn)行攻毒,攻毒前4h、攻毒感染后8h,0.2mg給藥劑量即可100%保護(hù)小鼠;攻毒24h后,0.4mg給藥劑量的小鼠存活率為75%。小鼠實(shí)驗(yàn)證明,制備的精制免疫球蛋白F(ab′)2對H7N9亞型流感有較好的預(yù)防和治療效果。綜上所述,本研究通過構(gòu)建感染模型發(fā)現(xiàn)了H7N9對哺乳動物致病的關(guān)鍵分子標(biāo)記。進(jìn)而,利用所構(gòu)建的H7N9亞型流感病毒小鼠感染模型證實(shí)H7N9亞型流感VLPs具有良好的免疫保護(hù)效果,而且馬抗H7N9亞型流感VLPs精制免疫球蛋白F(ab′)2在預(yù)防和治療H7N9亞型流感中表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值,為H7N9亞型流感治療藥物和疫苗的研制提供了科技支撐。
[Abstract]:H7N9 subtype influenza virus is a new influenza virus, first discovered in March 2013 in Shanghai and Anhui, by the end of February 22, 2017, the global total reported 1230 cases of influenza a H7N9 virus infection, including 428 deaths, the mortality rate reached 34.80%. at present, many countries have embarked on the H7N9 influenza virus diagnosis disease prevention and other related product development work. For the high risk population, vaccination is an effective means of prevention; for susceptibles and infected patients, passive immunization is an effective prevention and emergency treatment. Therefore, it is necessary to develop safe, effective, economical and practical treatment of influenza vaccine and antibody the pathogenicity of influenza virus is mainly affected by the molecular characteristics of virus and host species differences, construction of influenza virus infected animal model of pathogenic molecular mechanism of virus will be carried out. Help us for the disease prevention and treatment of immune.Palladino A influenza virus neutralizing monoclonal antibodies for the treatment of immunodeficiency infected mice, showed good therapeutic effect, suggesting that antibody therapy could be effective against future influenza H7N9 in one of the human antibody is the most ideal therapeutic antibodies but the short term is difficult to obtain a large number of people from the serum, so the heterologous antibody (animal IgG) antibody treatment at this stage will become one of the alternative means. In a variety of animal, horse serum products production and use of more than 100 years of history, it is easy to large-scale preparation, good specificity, preparation the advantages of the relatively short period, in response to the traditional disease and new onset / infectious disease has played an important role in this study. Based on the development of horse anti influenza H7N9 purified immunoglobulin as the research object, the first We first establish a H7N9 influenza virus infected mice model, provides a platform for the evaluation of therapeutic antibodies of H7N9 influenza; secondly, the expression system in insect cells, baculovirus, packaging containing A/Shanghai/2/2013 (H7N9) HA strain, virus like particles of NA and M1 protein (virus-like particles, VLPs), and study the original in vitro biological activity test and mice immune to VLPs; finally, using VLPs as immunogen by optimizing the production process of horses, horse serum was obtained for further refining, horse anti H7N9 virus purified immunoglobulin influenza virus subtype F (AB) 2, and evaluate the effect of prevention and treatment of.1. H7N9 subtype of influenza virus infection in mice model and study the pathogenic molecular basis of selected BALB/c mice as experimental animal model, A/Shanghai/2/2013 (H7N9) strains by rat lung even to obtain mouse adapted strain P10M generation http 1, P10M2 and P10M3. in mice by median lethal dose, mortality, viral replication efficiency, tissue tropism and evaluation index, successfully established the H7N9 subtype of influenza virus infected mice model was established to evaluate the preventive effect of H7N9 platform influenza therapeutics and vaccines. Genomic sequence analysis showed that PA, HA, NA and several sites of M and NP gene mutation, which may be speculated that the discovery of PA-T97I H7N9 subtype influenza virus on the molecular basis of mammalian pathogenicity enhanced.2, H7N9 subtype influenza virus like particles prepared by insect cells, baculovirus expression system, constructed the expression of A/Shanghai/2/2013 (H7N9) HA strain, recombinant baculovirus, NA and M1 by PCR, indirect immunofluorescence and Western blot identification, the target protein was successfully expressed. The recombinant baculovirus infected insect cells successfully assembled H7N9 subtype influenza virus like. The particles could be observed under TEM spherical, diameter of about 100nm, the surface of the typical spike of influenza VLPs, hemagglutination titer of 1:27~1:28. VLPs by intramuscular injection or nasal drops, BALB/c mice were immunized with 10 g VLPs/, two, two weeks after immunization, in H7N9 subtype influenza virus strain 10MLD50 dose in mice the attack, can provide protective immunity in mice 100%. Therefore, the preparation of the H7N9 subtype of influenza VLPs has good immunogenicity, immune system H7N9 influenza immune globulin preparation has laid the foundation of.3, H7N9 subtype influenza virus purified immunoglobulin on VLPs system preparation of immunized horses, five free after HI antibody titer of hyperimmune serum 1:10240. Using the H7N9 subtype of influenza virus infection in mice has been constructed model, were challenged with 10 MLD50 with nasal drops, before attacking poison 36h, after infection of 24h mice respectively by intraperitoneal injection of 0. 2ml hyperimmune serum, the survival rate of mice was 100%, while the control group all died. This proves that the preparation of horse anti influenza virus subtype H7N9 hyperimmune serum with emergency good prevention and treatment effects of the infection of influenza virus. Based on the traditional horse anti serum purification technology, improved and the optimization of preparation process, using enzyme digestion and purification to remove the antibody Fc fragment, affinity chromatography purification of immunoglobulin F (AB) 2. by SDS-PAGE, TLC scanning, the results show that the purified immunoglobulins obtained by F (AB) 2 purity was above 93%. The fixed virus immunoglobulin - dilution method, the neutralizing antibody titers measured for 1:5120. by H7N9 subtype of influenza virus infection in mice has been constructed model, were challenged with 10 MLD50 with nasal drops, before attacking poison 4H infection after 8h and 0.2mg administration can protect small dose 100% Rat; attack 24h, 0.4mg dosage, the survival rate of mice was demonstrated in 75%. mice, purified preparation of immunoglobulin F (AB) has good preventive and therapeutic effect of 2 H7N9 influenza. In summary, this study builds the infection model of H7N9 was found on key molecules in mammals pathogenic markers. Furthermore, the use of H7N9 subtype influenza virus infection model of mice confirmed H7N9 influenza VLPs has good immune protection effect, and horse anti influenza H7N9 VLPs purified immunoglobulin F (AB) 2 in the prevention and treatment of influenza H7N9 showed potential application value and to provide scientific support for the development of influenza H7N9 therapeutics and vaccines.

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1394140