本文關(guān)鍵詞：血管平滑肌細(xì)胞特異性SCAP基因敲除引起胚胎致死性實(shí)驗(yàn)研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： SCAP SREBP2 胚胎致死性 全基因轉(zhuǎn)錄組測序

【摘要】：目的:固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Protein,SREBPs)裂解激活蛋白(SREBP Cleavage Activating Protein,SCAP)又稱膽固醇敏感器,可反饋調(diào)控與膽固醇攝取和內(nèi)源性合成相關(guān)基因即低密度脂蛋白受體(Low Density Lipoprotein Receptor,LDLr)及羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(Hydroxy Methylglutaryl Coenzyme A Reductase,HMGCoAR)的表達(dá)水平來保持機(jī)體細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)。有關(guān)SCAP以往的研究主要關(guān)注于它與脂質(zhì)代謝疾病相關(guān)性及其在維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡中的作用等方面。近年來,SCAP在細(xì)胞增殖、器官發(fā)育,甚至胚胎致死等方面中的作用受到了更廣泛的關(guān)注和研究。本研究通過構(gòu)建血管平滑肌特異性SCAP基因敲除小鼠,探討SCAP基因的缺失對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響,并初步探討其可能的分子機(jī)制。方法:SCAPflox/flox(stock Number:004162)轉(zhuǎn)基因小鼠和SM22-Cre+/-(stock Number:004746)工具鼠均購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。我們將雌性SCAPflox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠與雄性SM22-Cre+/-工具鼠交配獲得SCAP血管平滑肌特異性基因敲除小鼠。剪取小鼠尾巴,通過提取尾DNA用普通PCR擴(kuò)增鑒定和篩選小鼠基因型。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證SCAP雜合子(SM22-Cre/SCAPflox/+)驗(yàn)證小鼠SCAP基因敲除效果。將得到的sm22-cre/scapflox/+轉(zhuǎn)基因小鼠交配,分別于胚胎期e12.5d、e14.5d、e16.5d、e18.5d取胚胎或小鼠的組織(羊膜或肝臟)檢查基因型,并計(jì)算統(tǒng)計(jì)各基因型小鼠比例;體視顯微鏡下觀察純合子(實(shí)驗(yàn)組)和野生型(對(duì)照組)小鼠胚胎大體發(fā)育情況并拍照記錄。應(yīng)用rt-pcr技術(shù)檢測scap純合子(sm22-cre/scapflox/flox)e14.5d胚胎心臟scap基因的表達(dá)情況,然后取野生型和純合子兩組e14.5d心臟進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組測序(rna-seq),檢測scap血管平滑肌特異性敲除對(duì)小鼠e14.5d心臟中相關(guān)基因表達(dá)和信號(hào)通路的影響,從而對(duì)scap基因的缺失對(duì)胚胎發(fā)育的影響和其中可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步的分析探討。結(jié)果:1.我們成功構(gòu)建了scap血管平滑肌特異性敲除小鼠(以下簡稱為scap敲除小鼠),并且與野生型相比,雜合子scap在血管平滑肌敲除效率達(dá)50%左右。但小鼠基因型鑒定和篩選的結(jié)果發(fā)現(xiàn),有趣的是,子代小鼠中并未發(fā)現(xiàn)純合子小鼠(sm22-cre/scapflox/flox),子代均為雜合子小鼠(sm22-cre/scapflox/+)或者其他野生型小鼠。提示scap缺失導(dǎo)致純合子小鼠胚胎期死亡。2.對(duì)小鼠的胚胎作進(jìn)一步基因型的鑒定和篩選發(fā)現(xiàn),在e14.5d之前,小鼠的基因型中野生型:雜合子:純合子比例約為1:2:1,但是從e16.5d以后,純合子的比例明顯減少,至e18.5d比例下降為0,同時(shí)對(duì)e12.5d、e13.5d、e14.5d、e15.5d胚胎解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)從e14.5d胚胎出現(xiàn)明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,e15.5d胚胎明顯萎縮,,而且胎內(nèi)有輕微出血,說明scap基因的完全缺失從14.5開始出現(xiàn)明顯異常,并逐漸導(dǎo)致胚胎死亡。3.RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型相比,SCAP在純合子E14.5d心臟中的敲除率達(dá)到80%。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,在平滑肌特異性SCAP基因敲除純合子小鼠E14.5d心臟中,實(shí)驗(yàn)組與野生組相比:SCAP/SREBP2信號(hào)通路與脂糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)水平明顯下降,胚胎脂糖代謝不足,導(dǎo)致能量代謝及供應(yīng)不足;PPAR信號(hào)通路相關(guān)的基因表達(dá)水平明顯下降,導(dǎo)致胎盤功能障礙;血小板活性及凝血功能低下,導(dǎo)致胚胎易出血或凝血時(shí)間延長;固有免疫系統(tǒng)亢進(jìn),炎癥反應(yīng)增加;細(xì)菌、病毒信號(hào)通路激活,可能引起胚胎宮內(nèi)易感染;與胚胎或心臟發(fā)育有關(guān)的差異基因表達(dá)下調(diào),可能導(dǎo)致心臟發(fā)育障礙,推測以上原因均可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良最終引起胚胎死亡致死。結(jié)論:血管平滑肌細(xì)胞特異性SCAP基因敲除可引起純合子胚胎發(fā)育障礙導(dǎo)致胚胎致死,其機(jī)制可能與SCAP的缺失影響脂糖等能量代謝,PPAR信號(hào)通路,血小板活性及凝血功能,炎癥反應(yīng)、固有免疫、胚胎或心臟發(fā)育等綜合因素有關(guān)。
[Abstract]:Objective : To study the effect of SCAP gene deletion on mouse embryo development by using SCAP hybrid mouse and SM22 - cre / SCAPflox / + mice . Conclusion : Compared with wild - type mice , the gene expression level of mouse embryo is significantly decreased , and its mechanism may lead to the death of embryo . Conclusion : The deletion of SCAP gene may lead to fetal death . The mechanism of the gene expression of SCAP / SCAP gene is related to the metabolism of energy , PPAR signal pathway , platelet activity and coagulation function , inflammatory response , innate immunity , embryo or cardiac development .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R3416

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