本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞的干性在多級(jí)細(xì)胞調(diào)控中的作用及機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是中胚層來(lái)源的具有干性的細(xì)胞,能在增殖的同時(shí)保持多向分化潛能,并能在特定情況下誘導(dǎo)分化為多種組織。這一獨(dú)特的屬性為MSCs在組織工程和臨床治療上展示了良好的應(yīng)用前景。然而目前MSCs在體外增殖過(guò)程中仍存在增殖能力和干性逐漸喪失的困擾。因此,了解和認(rèn)識(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞干性維持的外在培養(yǎng)條件和內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制已成為當(dāng)前MSCs研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。另一方面,間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)共培養(yǎng)是目前組織工程骨發(fā)展策略中的一大焦點(diǎn)。但是MSCs的成骨能力與ECs的成血管效應(yīng)間的相互作用以及偶聯(lián)兩個(gè)進(jìn)程的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制仍不明了。本研究通過(guò)三種培養(yǎng)基的比較鑒定出有利于MSCs干性維持的培養(yǎng)條件,同時(shí)篩選出關(guān)鍵調(diào)控基因KLF2并探討其在MSCs干性維持中的作用。并以此為基礎(chǔ),進(jìn)一步揭示MSCs的干性維持在MSCs的成骨作用與ECs的成血管效應(yīng)間所起的主導(dǎo)作用。這一研究從一個(gè)新的視角探索了間充質(zhì)干細(xì)胞的干性維持在多級(jí)細(xì)胞調(diào)控中的重要作用,為組織工程新策略的開(kāi)發(fā)提供了重要的指導(dǎo)方向。第一部分間充質(zhì)干細(xì)胞干性維持的體系構(gòu)建間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有干性的細(xì)胞,能夠誘導(dǎo)分化為多種組織,因而在組織工程和臨床治療上具有巨大的應(yīng)用潛力。然而目前MSCs在體外增殖過(guò)程中仍存在增殖能力和干性逐漸喪失的困擾。因此,了解和認(rèn)識(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞干性維持的外在培養(yǎng)條件和內(nèi)在關(guān)鍵靶基因已成為當(dāng)前MSCs研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究通過(guò)比較人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)在三種培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài),增殖能力,表面標(biāo)志物及分化相關(guān)基因的表達(dá)分析,鑒定出最有利于hMSCs增殖和干性維持的培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上篩選出與其干性相關(guān)的關(guān)鍵基因 KLF2(Kruppel like transcription factor 2),并通過(guò)基因沉默實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析 KLF2對(duì)于hMSCs干性維持的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF2沉默后,hMSCs的增殖能力,克隆形成能力及三向分化能力均明顯下調(diào)�；虮磉_(dá)分析顯示KLF2沉默的hMSCs,其多能性相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下調(diào),而分化相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào),進(jìn)一步提示KLF2對(duì)于hMSCs干性維持的促進(jìn)作用。本研究鑒定出有利于人間充質(zhì)干細(xì)胞干性維持的外在培養(yǎng)條件,并進(jìn)一步揭示其內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制,為hMSCs廣泛應(yīng)用于組織工程和臨床治療提供必要的前期基礎(chǔ)。第二部分干性介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間的協(xié)同作用間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)是目前血管化骨發(fā)展策略中的一大焦點(diǎn)。但是MSCs的成骨與ECs的成血管效應(yīng)間的相互作用以及偶聯(lián)兩個(gè)進(jìn)程的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制仍不明了。本研究證實(shí)人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)之間能通過(guò)一種智能的協(xié)同作用來(lái)獲得更好的骨化,即干性維持的hMSCs能夠起始并促進(jìn)HUVECs的成血管作用并反過(guò)來(lái)刺激自身的成骨效應(yīng)。通過(guò)前期研究證實(shí),hMSCs的干性維持可由三種不同的培養(yǎng)基以及關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子KLF2來(lái)進(jìn)行調(diào)控。沉默KLF2能夠下調(diào)hMSCs的干性以及HUVECs的成血管作用,并最終獲得較差的成骨效應(yīng)。機(jī)制研究顯示干性維持的hMSCs可能通過(guò)激活NANOG-OCT4-SOX2這一關(guān)鍵的多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而誘導(dǎo)bFGF(堿性成纖維生長(zhǎng)因子)的釋放,從而上調(diào)VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的表達(dá)量來(lái)共同促進(jìn)HUVECs的成血管效應(yīng)。同時(shí),VEGF的上調(diào)能夠通過(guò)作用于HUVECs來(lái)調(diào)控hMSCs與HUVECs間的交互作用,進(jìn)而反過(guò)來(lái)刺激hMSCs的成骨作用。應(yīng)用水凝膠進(jìn)行3D(三維)共培養(yǎng)進(jìn)一步證實(shí)干性維持的hMSCs能夠促進(jìn)HUVECs的毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)的形成。這一研究揭示了干性介導(dǎo)下hMSCs與HUVECs之間的智能的協(xié)同效應(yīng),并且對(duì)骨組織工程新策略的提出具有深遠(yuǎn)的影響。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) is derived from mesoderm dry cells can maintain multilineage differentiation potential in proliferation and differentiation at the same time, for a variety of organizations in certain circumstances. This unique property is MSCs shows a good application prospect in tissue engineering and clinical treatment. However. The proliferation ability and dry gradually lose the problems still exist in the process of the proliferation of MSCs. Therefore, understanding and knowledge of mesenchymal stem cells to maintain the dry cultivation conditions of external and internal regulatory mechanisms has become a hotspot and difficulty in the research of MSCs. On the other hand, mesenchymal stem cells and vascular endothelial cells (endothelial cells, ECs) co culture is currently a major focus of the development strategy in bone tissue engineering. But MSCs osteogenic ability and ECs interaction effect between vascular and coupling process in two The regulation mechanism is still unclear. In this study, through three kinds of culture medium is conducive to identify culture conditions of dry MSCs maintained, while screening out key regulatory gene KLF2 and to explore the role of MSCs in maintaining dry. And on this basis, further reveal the MSCs function and ECs in bone dry maintenance into the play the leading role of the vascular effects between MSCs. This study explored the mesenchymal stem cell self-renewal plays an important role in the regulation of multiple cells from a new perspective, and provides direction for the development of an important new strategy in tissue engineering. The part of mesenchymal stem cells to maintain the dry system construction of mesenchymal stem cell is a kind of dry cell, can differentiate into various tissues, have great potential applications in tissue engineering and clinical treatment. However, so in the process of proliferation of MSCs in vitro There are still proliferation and dry gradually lose problems. Therefore, understanding and knowledge of mesenchymal stem cell culture conditions of external and internal stemness of key target genes has become a hotspot and difficulty in the research of MSCs. This study compares human mesenchymal stem cells (human mesenchymal stem cells, hMSCs) proliferation in three culture medium, cell morphology, expression analysis and differentiation related gene identification of surface markers, the most beneficial medium for proliferation and maintenance of dry hMSCs. On the basis of screening and dry key genes related KLF2 (Kruppel like transcription factor 2), and through the further analysis of KLF2 gene silencing experiments for hMSCs dry to maintain the effect. The results showed that KLF2 gene silencing, hMSCs proliferation, colony formation ability and three differentiation ability were significantly reduced. The analysis showed the gene expression of KLF2 silencing HMSCs, the expression of related genes can be significantly reduced, and the expression of differentiation related genes, further suggesting that KLF2 for hMSCs dry maintain promotion. This study identified in favor of human mesenchymal stem cells self-renewal external culture conditions, and further reveal the internal mechanism for. HMSCs is widely used in tissue engineering and clinical treatment provide a necessary foundation. The second part dry mediated stromal synergistic effect of mesenchymal stem cells and vascular endothelial cells in co culture is currently a major focus of vascularized bone development strategy. Cells and vascular endothelial cells between the bone and ECs but MSCs the interaction effect between the vessel and coupling the two processes of the internal adjustment mechanism is still unclear. This study confirmed that human mesenchymal stem cells (human mesenchymal stem cells, hMSCs) and human umbilical vein Endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) by a synergy between intelligence to get better ossification, dry hMSCs can maintain and promote angiogenesis starting HUVECs and stimulated the osteogenic effect of itself. Through the preliminary study confirmed that hMSCs can keep dry by three different the medium and the key transcription factor KLF2 to regulate vascular function. KLF2 can silence the down-regulation of hMSCs and HUVECs dry, and finally get the osteogenic effect is poor. Research on the mechanism of stemness of hMSCs may display through the activation of NANOG-OCT4-SOX2 which is a key to control network, thereby inducing bFGF (basic fibroblast growth factor) release, upregulation of VEGF (vascular endothelial growth factor) expression to jointly promote the HUVECs into vascular effects. At the same time, the adjustment to VEGF Effect on the interaction of hMSCs between HUVECs and HUVECs, which in turn stimulates osteogenesis of hMSCs. Application of hydrogel 3D (3D) co culture form further confirmed that hMSCs can promote the stemness of HUVECs capillary like network. This study reveals the synergistic effect of dry mediated between hMSCs and intelligent HUVECs, and put forward a new strategy of bone tissue engineering has a profound influence.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1382911