本文關(guān)鍵詞：TREM-1對(duì)大腸桿菌或雙鏈RNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的調(diào)控作用及分子機(jī)制　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：致病原感染機(jī)體后,其本身固有的特殊成分——病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs)能夠被機(jī)體先天免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識(shí)別,一方面啟動(dòng)病原的吞噬、清除和殺傷,一方面激活機(jī)體炎癥反應(yīng)。而由嚴(yán)重感染所致失控性炎癥反應(yīng)是引發(fā)感染患者多器官功能損傷、甚至衰竭的重要原因。由于其病死率高,目前還缺乏十分有效的防治手段。新近的研究證實(shí)表達(dá)于髓樣細(xì)胞的TREM-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1)在先天免疫系統(tǒng)中具有重要調(diào)控作用。該受體活化能夠顯著上調(diào)革蘭陰性細(xì)菌/LPS作用于多形核白細(xì)胞后多種促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,顯著放大感染相關(guān)炎癥信號(hào),在感染所致膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,故極有可能是抗膿毒癥治療研究的重要靶分子。而革蘭陰性細(xì)菌通過(guò)其表面的LPS作用于TLR4(Toll-like receptor 4)/MD-2(Myeloid differentiation protein-2)受體復(fù)合體觸發(fā)的炎癥信號(hào)的過(guò)度放大是內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展基礎(chǔ),但以此為靶分子抑制LPS觸發(fā)放大的炎癥信號(hào)治療內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型并不一定能取得良好的療效。其原因可能是干預(yù)TLR4/MD-2受體復(fù)合體的功能對(duì)先天免疫系統(tǒng)內(nèi)化、殺傷、清除革蘭陰性細(xì)菌和LPS影響甚巨,導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。TREM-1受體雖然對(duì)炎癥信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大具有重要調(diào)控作用,但該受體是否對(duì)于先天免疫系統(tǒng)識(shí)別、吞噬、殺傷、清除革蘭陰性細(xì)菌/LPS有作用以及作用的大小尚沒(méi)有完全認(rèn)識(shí)清楚。鑒于此,本研究通過(guò)基因工程方法構(gòu)建表達(dá)EGFP的大腸桿菌,以此為工具研究證實(shí)了TREM-1活化對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)化及細(xì)胞內(nèi)殺傷大腸桿菌具有促進(jìn)作用。由于TREM-1為髓樣細(xì)胞表面的一種膜受體,本身缺乏識(shí)別LPS/大腸桿菌的分子結(jié)構(gòu),故直接參與巨噬細(xì)胞內(nèi)化大腸桿菌過(guò)程的可能性不大。為深入探討可能機(jī)制,本研究通過(guò)構(gòu)建慢病毒并感染RAW264.7細(xì)胞獲得差異表達(dá)TREM-1的細(xì)胞株,并運(yùn)用基因芯片技術(shù)比較了差異表達(dá)TREM-1的細(xì)胞株之間的全基因組表達(dá)譜差異,以期探討差異表達(dá)TREM-1對(duì)內(nèi)化大腸桿菌關(guān)鍵受體或信號(hào)分子的影響。在構(gòu)建差異表達(dá)TREM-1細(xì)胞株的過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的現(xiàn)象。即對(duì)照慢病毒感染的細(xì)胞株,TREM-1表達(dá)顯著升高。而已知慢病毒的感染過(guò)程為所謂的“自殺式感染”,感染后可將靶序列整合到宿主細(xì)胞基因組,但并不會(huì)復(fù)制包裝產(chǎn)生新的病毒。而整合到宿主基因組的序列可不斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生新的ds RNA。這說(shuō)明對(duì)照慢病毒產(chǎn)生的外源性亂序ds RNA可以誘導(dǎo)TREM-1表達(dá)上調(diào)。而ds RNA是雙鏈RNA病毒最主要的PAMPs之一,機(jī)體的免疫細(xì)胞則是通過(guò)其PRRs識(shí)別胞漿或內(nèi)體中的ds RNA,進(jìn)而分泌Ⅰ型干擾素和炎癥介質(zhì),產(chǎn)生抗病毒免疫,并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。盡管已有多項(xiàng)研究證實(shí)TREM-1受體參與調(diào)控了機(jī)體先天免疫系統(tǒng)對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、真菌及病毒產(chǎn)生的多種PAMPs的識(shí)別及后續(xù)信號(hào)過(guò)程,但TREM-1受體是否在機(jī)體先天免疫系統(tǒng)識(shí)別ds RNA后產(chǎn)生的抗病毒免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用還缺乏深入的認(rèn)識(shí)。故本研究證實(shí)外源性ds RNA能夠上調(diào)TREM-1的表達(dá),且TREM-1活化可能正向調(diào)控ds RNA誘導(dǎo)的抗病毒免疫,而TREM-1的這種調(diào)節(jié)效應(yīng)與該受體活化能夠上調(diào)MAPK信號(hào)通路活性及病毒感染相關(guān)的PRRs表達(dá)有關(guān)。主要的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:1.分別用經(jīng)2%血清調(diào)理素化的和未經(jīng)調(diào)理的大腸桿菌BL21(DE3)plys S感染BMDMs,12hrs后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)上清中TNF-α和IL-6的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染經(jīng)血清調(diào)理或未調(diào)理的大腸桿菌的細(xì)胞培養(yǎng)上清中,TNF-α和IL-6的分泌均明顯上調(diào)(P0.01);而用TREM-1激動(dòng)型抗體活化該受體后再感染細(xì)菌,則TNF-α和IL-6的分泌效應(yīng)被顯著放大(P0.05);而單獨(dú)比較調(diào)理素化和未調(diào)理細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激作用,則發(fā)現(xiàn)調(diào)理素化細(xì)菌對(duì)TNF-α和IL-6的分泌具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用(P0.05)。2.通過(guò)基因工程方法構(gòu)建EGFP原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化入表達(dá)大腸桿菌后,通過(guò)誘導(dǎo)EGFP表達(dá)使細(xì)菌攜帶穩(wěn)定綠色熒光,從而獲得能夠可視化研究吞噬細(xì)胞內(nèi)化細(xì)菌過(guò)程及通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量、高通量測(cè)定吞噬細(xì)胞內(nèi)化能力的有力工具。3.使用TREM-1受體激動(dòng)型抗體與BMDMs孵育半小時(shí)活化該受體,加入細(xì)菌感染細(xì)胞半小時(shí),可檢測(cè)到TREM-1受體活化的細(xì)胞內(nèi)化有細(xì)菌的比例顯著增加,細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯著增加,吞噬系數(shù)增高(P0.01)。在不同時(shí)像點(diǎn)收集保本檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)TREM-1活化促進(jìn)BMDMs對(duì)大腸桿菌的吞噬。同時(shí),也采用同樣方法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)化大腸桿菌的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)化大腸桿菌的能力弱于BMDMs,且TREM-1受體活化不能顯著上調(diào)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)化大腸桿菌能力。4.用TREM-1受體激動(dòng)型抗體與巨噬細(xì)胞孵育半小時(shí)后,向細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入熒光標(biāo)記乳膠微球和中性紅顆粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞非特異胞飲能力并未增強(qiáng),而作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照的經(jīng)LPS刺激半小時(shí)的BMDMs的胞飲能力顯著增強(qiáng)(P0.01)。5.同樣激活BMDMs的TREM-1受體,并使其內(nèi)化大腸桿菌。然后用抗生素殺滅胞外菌后,再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞5hrs進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)殺傷大腸桿菌,通過(guò)裂解細(xì)胞進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)TREM-1受體活化的BMDMs的細(xì)胞內(nèi)殺傷大腸桿菌的能力顯著增強(qiáng)(P0.05)。6.慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞,對(duì)照慢病毒感染組細(xì)胞的TREM-1表達(dá)上調(diào),而敲減TREM-1表達(dá)并不影響TLR4、MD-2表達(dá)。TREM-1受體活化增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)化革蘭陰性細(xì)菌,可能與該受體活化調(diào)節(jié)TLR4受體功能及MAPK等信號(hào)通路有關(guān)。7.Poly IC刺激RAW264.7細(xì)胞,可劑量依賴(lài)地上調(diào)TREM-1的表達(dá)(P0.001),這一效應(yīng)可被PI3K、MAPK信號(hào)通路抑制劑阻斷(P0.01)。Poly IC刺激BMDMs可持續(xù)上調(diào)TREM-1表達(dá),在刺激后36hrs達(dá)到高峰,而LPS誘導(dǎo)的TREM-1表達(dá)上調(diào)在24hrs即達(dá)到高峰,隨后下跌。短片段ds RNA對(duì)TREM-1表達(dá)同樣具有誘導(dǎo)作用。8.細(xì)胞與激動(dòng)型anti-TREM-1抗體孵育活化TREM-1,再經(jīng)Poly IC刺激后,其MAPK信號(hào)通路的JNK、ERK1/2和P38的磷酸化發(fā)生更早,磷酸化水平更高,而且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),MAPK信號(hào)通路活化程度增強(qiáng)。9.經(jīng)TREM-1激動(dòng)型抗體處理的BMDMs細(xì)胞受到Poly IC刺激活化后,IFN-β、TNF-α、IL-6的分泌水平顯著上調(diào)(P0.01),IL-1β、IL-10、MCP-1的m RNA轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)。且RAW264.7細(xì)胞與BMDMs細(xì)胞的TREM-1受體功能存在差異。10.TREM-1受體活化的BMDMs細(xì)胞受Poly IC刺激后,MDA5、TLR3和TLR7受體表達(dá)上調(diào);而受到短片段ds RNA刺激后表現(xiàn)為RIG-I表達(dá)上調(diào)。RAW264.7細(xì)胞的上述受體表達(dá)存在異常。結(jié)論:1.TREM-1受體活化選擇性促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)化和細(xì)胞內(nèi)殺傷大腸桿菌,從而上調(diào)促炎癥介質(zhì)分泌,但并不增強(qiáng)細(xì)胞非特異的胞飲能力。2.敲減TREM-1表達(dá)并不能改變TLR4、MD-2等內(nèi)化革蘭陰性細(xì)菌相關(guān)基因的表達(dá)。TREM-1促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)化革蘭陰性細(xì)菌能力的機(jī)制可能與該受體活化能調(diào)節(jié)TLR4/MD-2受體復(fù)合體功能及細(xì)胞MAPK等信號(hào)通路活化狀態(tài)有關(guān)。3.基因組表達(dá)譜芯片及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ds RNA刺激巨噬細(xì)胞能上調(diào)TREM-1的表達(dá),存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性。4.TREM-1活化狀態(tài)對(duì)ds RNA誘導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,參與病毒感染過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展;而這種調(diào)節(jié)作用與其能協(xié)同增強(qiáng)MAPK信號(hào)通路活化及病毒相關(guān)PRR表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1350668