本文關鍵詞：鞭毛素蛋白作為鼻腔黏膜佐劑調(diào)節(jié)呼吸道DC功能并增強IgA應答的機制研究　出處：《中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：鞭毛素(flagellin)是細菌鞭毛絲狀體的主要結構蛋白。作為一類獨特的細菌病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),flagellin具有激活Toll-like receptor 5(TLR5)和NLR family CARD domain containing 4(NLRC4)兩條信號通路的免疫活性。大量研究表明,flagellin能以TLR5和/或NLRC4通路依賴的方式有效激活免疫應答,可以作為免疫佐劑有效增強疫苗抗原特異性的免疫應答。近年來一系列研究證明flagellin蛋白更是一種優(yōu)良的黏膜免疫佐劑,能通過黏膜免疫途徑顯著提高疫苗抗原特異的黏膜IgA應答,并提高疫苗保護效應。然而,flagellin作為黏膜佐劑增強特異IgA免疫應答的作用過程及其免疫學機制尚知之甚少。本論文采用小鼠鼻腔免疫模型,對重組flagellin蛋白在鼻腔黏膜上皮細胞的攝入、與黏膜局部免疫細胞的相互作用、以及增強黏膜特異IgA應答效應和分子機制等方面進行了系統(tǒng)研究。第一,觀察并測定了經(jīng)鼻免疫小鼠后,flagellin蛋白在小鼠鼻腔黏膜局部的攝入和分布特征。免疫組化分析顯示小鼠鼻腔黏膜上皮細胞(murine nasal epithelial cells,mNECs)在腔面高表達TLR5,但flagellin在野生型(WT)和TLR5基因敲除(TLR5 KO)小鼠的鼻腔內(nèi)均能被mNECs有效攝取并快速(0.5h)分布到黏膜固有層。流式細胞分析顯示flagellin-EGFP融合蛋白在鼻腔黏膜下可快速被鼻腔樹突狀細胞(nasal DC)攝取(2h)。由此,我們發(fā)現(xiàn)并證明:flagellin蛋白能以非TLR5依賴的方式迅速而有效地被鼻腔黏膜上皮細胞攝取并分布于黏膜固有層,且能被鼻腔黏膜下nasal DC有效攝取。第二,進一步觀察和測定了flagellin蛋白作為佐劑經(jīng)鼻腔黏膜攝入后與呼吸道DC的相互作用和效應。使用flagellin作為黏膜佐劑與抗原OVA-AlexaFluor647混合滴鼻免疫小鼠,我們發(fā)現(xiàn):與單純熒光抗原OVA免疫組相比,flagellin不能提高nasal DC中OVA+DC比例及nasal DC所含的OVA量(2h),但能提高WT小鼠頸部引流淋巴結(CLN)中OVA+DC數(shù)目,且明顯上調(diào)CLN DC表面CD80/CD86分子(18h)。采用離體DC與na?ve B細胞體外共培養(yǎng)模型,我們從flagellin免疫后的WT及TLR5 KO小鼠體內(nèi)分離CLN DC(18h),分別檢測離體CLN DC促進na?ve B細胞抗體應答的能力,結果顯示:flagellin滴鼻免疫調(diào)節(jié)的WT CLN DC能夠增加B細胞中IgA+細胞數(shù)目,并增強IgA分泌。由此,我們發(fā)現(xiàn)并證明:flagellin作為鼻腔黏膜佐劑,并不促進DC對免疫抗原的攝取,而是以TLR5依賴的方式促進DC的活化、DC遷移以及介導IgA應答。第三,觀察分析了flagellin活化呼吸道DC并促進IgA應答的作用方式及分子機制。實驗結果表明:flagellin直接刺激呼吸道DC,能輕微上調(diào)DC表面CD80分子,但不能上調(diào)CD86分子。這種部分激活的DC不能增強na?ve B細胞的IgA應答。采用小鼠原代mNECs體外培養(yǎng)模型,我們發(fā)現(xiàn)鼻腔黏膜上皮細胞是flagellin活化呼吸道DC及促進后續(xù)IgA應答的一個必須環(huán)節(jié)。實驗結果表明,flagellin必須通過激活mNECs的TLR5通路,才能將激活信號傳遞到DC,賦予DC增強na?ve B細胞IgA應答的能力。進一步采用細胞因子芯片結合特異性中和抗體阻斷等實驗技術,確認了GM-CSF是TLR5激活的mNECs傳遞激活信號并調(diào)節(jié)DC功能的關鍵細胞因子。本部分研究證明了flagellin間接激活黏膜DC的模式,并揭示了GM-CSF在介導TLR5激活的mNECs調(diào)節(jié)DC功能、增強特異性IgA應答中的重要作用。綜上所述,本論文證明了flagellin蛋白在鼻腔黏膜局部可被mNECs快速有效攝入,此攝入過程不依賴TLR5。進入到黏膜下的flagellin蛋白不能直接激活呼吸道DC,而是通過激活mNEC/TLR5產(chǎn)生的GM-CSF等細胞因子調(diào)節(jié)DC功能進而增強IgA應答。因此,本論文系統(tǒng)闡明了鞭毛素蛋白鼻腔免疫的黏膜佐劑效應及其調(diào)節(jié)呼吸道DC功能并增強IgA應答的分子機制,發(fā)現(xiàn)了GM-CSF在這一免疫激活過程中的重要功能。研究結果為更有效利用重組鞭毛素蛋白進行黏膜疫苗的設計奠定了理論基礎,對進一步研究了解呼吸道黏膜免疫應答的獨特機制也具有重要參考價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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