本文關(guān)鍵詞：鞭毛素蛋白作為鼻腔黏膜佐劑調(diào)節(jié)呼吸道DC功能并增強(qiáng)IgA應(yīng)答的機(jī)制研究　出處：《中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：鞭毛素(flagellin)是細(xì)菌鞭毛絲狀體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。作為一類獨(dú)特的細(xì)菌病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),flagellin具有激活Toll-like receptor 5(TLR5)和NLR family CARD domain containing 4(NLRC4)兩條信號通路的免疫活性。大量研究表明,flagellin能以TLR5和/或NLRC4通路依賴的方式有效激活免疫應(yīng)答,可以作為免疫佐劑有效增強(qiáng)疫苗抗原特異性的免疫應(yīng)答。近年來一系列研究證明flagellin蛋白更是一種優(yōu)良的黏膜免疫佐劑,能通過黏膜免疫途徑顯著提高疫苗抗原特異的黏膜IgA應(yīng)答,并提高疫苗保護(hù)效應(yīng)。然而,flagellin作為黏膜佐劑增強(qiáng)特異IgA免疫應(yīng)答的作用過程及其免疫學(xué)機(jī)制尚知之甚少。本論文采用小鼠鼻腔免疫模型,對重組flagellin蛋白在鼻腔黏膜上皮細(xì)胞的攝入、與黏膜局部免疫細(xì)胞的相互作用、以及增強(qiáng)黏膜特異IgA應(yīng)答效應(yīng)和分子機(jī)制等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。第一,觀察并測定了經(jīng)鼻免疫小鼠后,flagellin蛋白在小鼠鼻腔黏膜局部的攝入和分布特征。免疫組化分析顯示小鼠鼻腔黏膜上皮細(xì)胞(murine nasal epithelial cells,mNECs)在腔面高表達(dá)TLR5,但flagellin在野生型(WT)和TLR5基因敲除(TLR5 KO)小鼠的鼻腔內(nèi)均能被mNECs有效攝取并快速(0.5h)分布到黏膜固有層。流式細(xì)胞分析顯示flagellin-EGFP融合蛋白在鼻腔黏膜下可快速被鼻腔樹突狀細(xì)胞(nasal DC)攝取(2h)。由此,我們發(fā)現(xiàn)并證明:flagellin蛋白能以非TLR5依賴的方式迅速而有效地被鼻腔黏膜上皮細(xì)胞攝取并分布于黏膜固有層,且能被鼻腔黏膜下nasal DC有效攝取。第二,進(jìn)一步觀察和測定了flagellin蛋白作為佐劑經(jīng)鼻腔黏膜攝入后與呼吸道DC的相互作用和效應(yīng)。使用flagellin作為黏膜佐劑與抗原OVA-AlexaFluor647混合滴鼻免疫小鼠,我們發(fā)現(xiàn):與單純熒光抗原OVA免疫組相比,flagellin不能提高nasal DC中OVA+DC比例及nasal DC所含的OVA量(2h),但能提高WT小鼠頸部引流淋巴結(jié)(CLN)中OVA+DC數(shù)目,且明顯上調(diào)CLN DC表面CD80/CD86分子(18h)。采用離體DC與na?ve B細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型,我們從flagellin免疫后的WT及TLR5 KO小鼠體內(nèi)分離CLN DC(18h),分別檢測離體CLN DC促進(jìn)na?ve B細(xì)胞抗體應(yīng)答的能力,結(jié)果顯示:flagellin滴鼻免疫調(diào)節(jié)的WT CLN DC能夠增加B細(xì)胞中IgA+細(xì)胞數(shù)目,并增強(qiáng)IgA分泌。由此,我們發(fā)現(xiàn)并證明:flagellin作為鼻腔黏膜佐劑,并不促進(jìn)DC對免疫抗原的攝取,而是以TLR5依賴的方式促進(jìn)DC的活化、DC遷移以及介導(dǎo)IgA應(yīng)答。第三,觀察分析了flagellin活化呼吸道DC并促進(jìn)IgA應(yīng)答的作用方式及分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:flagellin直接刺激呼吸道DC,能輕微上調(diào)DC表面CD80分子,但不能上調(diào)CD86分子。這種部分激活的DC不能增強(qiáng)na?ve B細(xì)胞的IgA應(yīng)答。采用小鼠原代mNECs體外培養(yǎng)模型,我們發(fā)現(xiàn)鼻腔黏膜上皮細(xì)胞是flagellin活化呼吸道DC及促進(jìn)后續(xù)IgA應(yīng)答的一個(gè)必須環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,flagellin必須通過激活mNECs的TLR5通路,才能將激活信號傳遞到DC,賦予DC增強(qiáng)na?ve B細(xì)胞IgA應(yīng)答的能力。進(jìn)一步采用細(xì)胞因子芯片結(jié)合特異性中和抗體阻斷等實(shí)驗(yàn)技術(shù),確認(rèn)了GM-CSF是TLR5激活的mNECs傳遞激活信號并調(diào)節(jié)DC功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本部分研究證明了flagellin間接激活黏膜DC的模式,并揭示了GM-CSF在介導(dǎo)TLR5激活的mNECs調(diào)節(jié)DC功能、增強(qiáng)特異性IgA應(yīng)答中的重要作用。綜上所述,本論文證明了flagellin蛋白在鼻腔黏膜局部可被mNECs快速有效攝入,此攝入過程不依賴TLR5。進(jìn)入到黏膜下的flagellin蛋白不能直接激活呼吸道DC,而是通過激活mNEC/TLR5產(chǎn)生的GM-CSF等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)DC功能進(jìn)而增強(qiáng)IgA應(yīng)答。因此,本論文系統(tǒng)闡明了鞭毛素蛋白鼻腔免疫的黏膜佐劑效應(yīng)及其調(diào)節(jié)呼吸道DC功能并增強(qiáng)IgA應(yīng)答的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了GM-CSF在這一免疫激活過程中的重要功能。研究結(jié)果為更有效利用重組鞭毛素蛋白進(jìn)行黏膜疫苗的設(shè)計(jì)奠定了理論基礎(chǔ),對進(jìn)一步研究了解呼吸道黏膜免疫應(yīng)答的獨(dú)特機(jī)制也具有重要參考價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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