本文關(guān)鍵詞：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶CD36在HBV病毒復(fù)制中的作用及分子機(jī)制研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 白細(xì)胞分化抗原36 乙型肝炎病毒 復(fù)制 鈣離子 Src酪氨酸激酶

【摘要】：目的乙型肝炎病毒(HBV)是一種與宿主代謝密切相關(guān)的病毒,宿主營(yíng)養(yǎng)及代謝狀態(tài)影響HBV病毒復(fù)制、合成及感染能力,而HBV感染也可明顯上調(diào)一些宿主代謝相關(guān)基因的表達(dá),如脂肪酸合成酶(FAS),當(dāng)敲低FAS的表達(dá)可以抑制HBV復(fù)制水平。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(CD36)是參與脂質(zhì)代謝過(guò)程的重要膜糖蛋白分子,在長(zhǎng)鏈脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝性炎癥的發(fā)生中起著重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn),CD36可與丙型肝炎病毒(HCV)E1蛋白相互作用促進(jìn)HCV的入侵與復(fù)制;CD36還影響人類免疫缺陷病毒(HIV)的組裝與分泌。有趣的是,我們?cè)诒磉_(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CD36表達(dá)水平顯著增加,因此,推測(cè)CD36表達(dá)水平變化可能與HBV生命活動(dòng)存在聯(lián)系。本研究擬探討脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶CD36是否會(huì)影響HBV復(fù)制及其可能的分子機(jī)制。方法在兩種HBV復(fù)制的HepG2.2.15、HepAD38細(xì)胞中,利用CD36過(guò)表達(dá)和靶向RNA干擾(RNAi)慢病毒構(gòu)建CD36過(guò)表達(dá)和CD36基因沉默細(xì)胞模型。用C57BL/6J野生型(WT)小鼠和CD36基因敲除(CD36KO)小鼠為動(dòng)物模型,經(jīng)尾靜脈水動(dòng)力注射PGEM-HBV1.3質(zhì)粒,建立hbv急性感染模型。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察cd36過(guò)表達(dá)和cd36基因敲低對(duì)hbv復(fù)制水平的影響。用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法篩選hepg2.2.15-cd36過(guò)表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的差異表達(dá)基因,以探尋cd36影響hbv復(fù)制的可能分子機(jī)制。以流式細(xì)胞技術(shù)分析cd36表達(dá)水平的改變對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響。使用鈣離子螯合劑bapta-am處理cd36過(guò)表達(dá)細(xì)胞,以及用提升胞漿內(nèi)鈣離子的毒胡蘿卜素處理cd36rnai細(xì)胞,提取hbvdna進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè),分析鈣離子試劑對(duì)cd36誘導(dǎo)的hbv復(fù)制的影響。用westernblotting方法檢測(cè)cd36過(guò)表達(dá)對(duì)src酪氨酸激酶磷酸化水平的影響,以src激酶抑制劑su6656處理cd36過(guò)表達(dá)細(xì)胞觀察hbv復(fù)制水平變化。結(jié)果southernblot及熒光定量pcr結(jié)果均顯示,無(wú)論是hepg2.2.15還是hepad38細(xì)胞中,cd36過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比,細(xì)胞中hbv的復(fù)制水平顯著增加;而cd36基因沉默后,hbv復(fù)制水平明顯下降。此外,cd36過(guò)表達(dá)組hbeag、hbsag的表達(dá)水平也高于對(duì)照組,cd36rna干擾組hbeag、hbsag的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。在急性hbv感染小鼠模型中,cd36ko抑制hbvdna水平以及hbeag、hbsag、hbcag的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,cd36過(guò)表達(dá)影響細(xì)胞內(nèi)一些離子通道蛋白和鈣離子結(jié)合蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示,cd36過(guò)表達(dá)可以增加細(xì)胞內(nèi)ca2+水平,而cd36基因沉默后的細(xì)胞內(nèi)ca2+水平呈下降趨勢(shì)。鈣離子螯合劑bapta-am降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子能抵消cd36過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的hbv復(fù)制增加,同樣毒胡蘿卜素能依靠增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平而恢復(fù)CD36基因沉默后所導(dǎo)致的HBV減少的趨勢(shì)。由于Src酪氨酸激酶與細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)和HBV復(fù)制相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn)CD36過(guò)表達(dá)能夠增加Src酪氨酸激酶磷酸化水平,而Src酪氨酸激酶抑制劑SU6656能夠抑制HBV復(fù)制。結(jié)論宿主脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子CD36可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和Src酪氨酸激酶途徑而調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制。該研究將有助于我們進(jìn)一步了解宿主營(yíng)養(yǎng)代謝與HBV間的關(guān)系,為未來(lái)通過(guò)調(diào)節(jié)宿主代謝而建立針對(duì)HBV的防治策略提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373.21

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