本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲(chóng)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的克隆及原核表達(dá)

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【摘要】：目的克隆剛地弓形蟲(chóng)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(TgPDI)基因,原核表達(dá)、純化重組TgPDI蛋白,并分析其免疫反應(yīng)性。方法制備弓形蟲(chóng)RH株速殖子總RNA,根據(jù)TgPDI基因全長(zhǎng)編碼序列(登錄號(hào)為AJ306291.2)的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)合成引物,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pET-30a(+)載體,重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgPDI轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli)DH5α,陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR、雙酶切并測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgPDI轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Rosetta(DE3),并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物;分別以抗His抗體和兔抗弓形蟲(chóng)血清為一抗,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)鑒定重組蛋白及其免疫反應(yīng)性;重組蛋白His-TgPDI通過(guò)Ni2+瓊脂糖凝膠親和層析柱純化,純化蛋白經(jīng)SDSPAGE分離,考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)分析其純度。結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 427 bp。菌落PCR、雙酶切及測(cè)序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgPDI構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果顯示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得約57 kDa的可溶性重組蛋白。Western blotting結(jié)果表明,誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白能被兔抗弓形蟲(chóng)血清識(shí)別。親和純化后獲得純度大于95%的重組TgPDI蛋白質(zhì)。結(jié)論克隆得到弓形蟲(chóng)PDI基因,原核表達(dá)并純化出該基因編碼的蛋白,且該重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室;太原師范學(xué)院生物系;山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81071374) 山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(01201103) 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院331科技啟動(dòng)基金(201202)
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5
【正文快照】： 剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng),可感染人類(lèi)和其他溫血?jiǎng)游颷1]。弓形蟲(chóng)速殖子侵入宿主細(xì)胞后不斷分裂、增殖,繼而破壞宿主細(xì)胞,而蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象對(duì)于速殖子的侵襲至關(guān)重要。弓形蟲(chóng)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)是本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)從可溶

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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1 周琳t，

本文編號(hào)：1297381