【摘要】 目的:顯微捕獲聯(lián)合低體積擴(kuò)增(Low volume polymerase chain reaction,LVPCR)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分離檢驗(yàn)為法醫(yī)混合微量生物檢材的檢驗(yàn)提供了有效途徑,但法醫(yī)實(shí)踐檢案的檢材細(xì)胞質(zhì)量良莠不齊,又含雜質(zhì)干擾等,致使鏡下目的細(xì)胞的辨識(shí)成為檢驗(yàn)結(jié)果好壞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究基于顯微捕獲儀平臺(tái),應(yīng)用組織學(xué)染色的原理,初步建立一種適用于顯微捕獲聯(lián)合LVPCR的細(xì)胞標(biāo)識(shí)方法,并評(píng)價(jià)在法醫(yī)實(shí)際應(yīng)用的效果。方法:取10名志愿者的口腔拭子及2個(gè)案例檢材為樣本,制作細(xì)胞懸液;配制0.05g/ml龍膽紫及2.5×10-4 g/ml亞甲基藍(lán)染液。通過(guò)濃度梯度及時(shí)間梯度染色,分別建立并優(yōu)化以龍膽紫、蘇木素、亞甲基藍(lán)為標(biāo)識(shí)物的細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉?基于顯微捕獲儀平臺(tái),分別對(duì)等量染色的口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行分離檢驗(yàn),比較3種染色法及染色時(shí)間對(duì)顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響,優(yōu)化細(xì)胞標(biāo)識(shí)物;應(yīng)用3者中較優(yōu)的染色法對(duì)志愿者口腔上皮細(xì)胞懸液染色,捕獲不同樣本等量染色及未染色細(xì)胞分離檢驗(yàn),并對(duì)同一樣本重復(fù)該操作20次,比較2種條件下檢測(cè)結(jié)果成功分型率的差異,評(píng)價(jià)該染色法在顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù)中的適用性;應(yīng)用于案例檢材的細(xì)胞分離檢驗(yàn),初步研究所建細(xì)胞標(biāo)識(shí)法的應(yīng)用效果。結(jié)果:室溫條件下,100μl細(xì)胞懸液加入0.5μl 0.05g/ml龍膽紫染液,染色5min,胞核呈紫紅色,與胞漿對(duì)比明顯,染色效果不隨染色時(shí)間(≤60min)延長(zhǎng)而明顯變化。優(yōu)化后的3種細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ň軐?duì)口腔上皮細(xì)胞胞核清晰標(biāo)識(shí),但龍膽紫染色細(xì)胞的分離檢驗(yàn)的成功分型率及有效分型率均高于另外兩種染色法,且染色時(shí)間(≤60min)對(duì)DNA檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響;而與未染色等量細(xì)胞分離檢驗(yàn)結(jié)果比較,不同樣本及同一樣本多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的成功分型率無(wú)明顯差異(p>0.05)。案例檢材應(yīng)用,目的細(xì)胞標(biāo)識(shí)清楚,較未染色時(shí)易于辨識(shí),捕獲到更多目的細(xì)胞,多次分離檢驗(yàn)結(jié)果疊加復(fù)合達(dá)同一認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論:龍膽紫細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ㄟm用于顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù),有助于提高該項(xiàng)技術(shù)中顯微捕獲儀平臺(tái)的檢測(cè)效能,并利于在法醫(yī)實(shí)踐檢案中應(yīng)用與推廣。

前  言

針對(duì)犯罪現(xiàn)場(chǎng)提取的乳頭擦拭物、精斑等混合疑難檢材中犯罪嫌疑人細(xì)胞的分離檢驗(yàn)，除免疫磁珠分離技術(shù)（精子）、流式細(xì)胞儀分離技術(shù)[1-2]等方法的研究外，國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)學(xué)者研究較多也較為成熟的屬顯微捕獲分離技術(shù)[3-5]。主要包括兩個(gè)技術(shù)平臺(tái)：1.顯微捕獲儀平臺(tái)；該平臺(tái)目前主要處理乳頭擦拭物，通過(guò)鏡下有核口腔上皮細(xì)胞（來(lái)源于犯罪嫌疑人）和無(wú)核角化上皮細(xì)胞碎片（來(lái)源于受害者皮膚）的辨識(shí)，捕獲目的細(xì)胞進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等DNA檢驗(yàn)，以獲取犯罪嫌疑人的單一 STR 分型，進(jìn)行同一認(rèn)定；2.激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）系統(tǒng)；此平臺(tái)目前主要處理女性成分較多、差異裂解法無(wú)法消除女性成分干擾的混合精斑，通過(guò)鏡下發(fā)現(xiàn)并捕獲精子進(jìn)行PCR 等 DNA 檢驗(yàn)。然而，疑難案件檢材中可捕獲到的目的細(xì)胞數(shù)量很少，屬低拷貝模板（Low copy number ，LCN），采用常規(guī) PCR 操作，難于獲得有效的 STR分型結(jié)果[6]。因此，我國(guó)公安部物證鑒定中心胡蘭學(xué)者的研究小組采用并優(yōu)化低體積擴(kuò)增技術(shù)，利用其高靈敏度[7-8]，降低對(duì)目的細(xì)胞數(shù)量的要求，從而建立了顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù)[9]。
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1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器
口腔拭子                            自制
煙蒂                                案件現(xiàn)場(chǎng)提取
乳頭擦拭物                          案件現(xiàn)場(chǎng)提取
龍膽紫染液                          自制
亞甲基藍(lán)染液                        自制
蘇木素染液                          北京冬歌生物科技有限公司
滅菌去離子水                        自制
AG480F AmpliGrid  微量反應(yīng)玻片        奧斯邦有限公司
Φ80μm毛細(xì)管玻璃吸針               德國(guó)艾本德有限公司
Identifier 試劑盒                       美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司
Olympus 倒置顯微鏡                   日本株式會(huì)社
顯微操作儀                          德國(guó) TransferMan NK2 型                

ASC200D AmpliSpeed 熱循環(huán)儀          奧斯邦有限公司
遺傳分析儀                          美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 3130XL型

1.2 細(xì)胞懸液制備及染液配制
口腔拭子：來(lái)源于10名志愿者，分別置于1.5ml 離心管中，加 1ml 滅菌去離子水，振蕩至液體懸濁，棄載體混勻，制成口腔上皮細(xì)胞懸液備用。煙蒂：剪取過(guò)濾嘴末端1cm×1cm紙質(zhì)部于1.5ml 離心管中，加1ml 滅菌去離子水，37℃孵育1h，期間渦旋振蕩數(shù)次；8 000r/min 套管離心 3min，棄載體及上清，留沉渣約 30μl，加180μl 滅菌去離子水，混勻備用。乳頭擦拭物：剪取棉簽表層棉團(tuán)于 1.5ml 離心管中，后續(xù)處理同煙蒂，制備脫落細(xì)胞懸液備用。 稱取5g龍膽紫晶體于消毒磨口燒瓶中，加90ml 滅菌去離子水及10ml 95%乙醇，攪拌至完全溶解，配制成0.05g/ml 龍膽紫染液[14]；稱取0.025 g亞甲基藍(lán)粉末于消毒磨口燒瓶中，加100 ml 無(wú)菌去離子水，振蕩至完全溶解，配制成2.5×10-4 g/ml 亞甲基藍(lán)染液[15]。蘇木素染液為購(gòu)買的成品。 

論文正文：顯微捕獲聯(lián)合低體積擴(kuò)增細(xì)胞標(biāo)識(shí)與法醫(yī)應(yīng)用研究..............................7

前  言..................................7

1  材料、儀器與方法........................ 9

2  結(jié)果 ......................................11

3  討論 ..................................... 22

結(jié)  論....................................25

3討論

3.1 細(xì)胞標(biāo)識(shí)法的建立和優(yōu)化
為盡量減少細(xì)胞標(biāo)識(shí)方法帶入的物質(zhì)對(duì)LVPCR的影響，根據(jù)堿性染料電離時(shí)產(chǎn)生的有色陽(yáng)離子可與染色質(zhì)（體）內(nèi)酸性物質(zhì)脫氧核糖核酸（帶負(fù)電荷），通過(guò)電荷間引力作用牢固結(jié)合，使胞核著色的原理[10]，選用 3 種常用堿性染料，通過(guò)染色濃度、時(shí)間的優(yōu)化，分別建立了龍膽紫、蘇木素及亞甲基藍(lán)細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ǎ荤R下觀察，3種方法的染色效果均達(dá)到細(xì)胞核標(biāo)記清晰、目的細(xì)胞易于辨識(shí)的要求。 鑒于5個(gè)新鮮口腔上皮細(xì)胞的分離檢驗(yàn)，目前已能較穩(wěn)定獲得成功分型結(jié)果，而除龍膽紫以外的另 2 種染液的引入，均導(dǎo)致成功分型率的明顯下降，提示蘇木素、亞甲基藍(lán)對(duì) LVPCR 有抑制作用，不適合在顯微捕獲聯(lián)合 LVPCR 中應(yīng)用；因此，龍膽紫細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ǎㄊ覝�，�?.5μl 0.05g/ml 龍膽紫染液于 100μl 細(xì)胞懸液，混勻靜置 5min，即鏡下觀察捕獲細(xì)胞）是 1 種可用于顯微捕獲聯(lián)合 LVPCR技術(shù)的細(xì)胞標(biāo)識(shí)法。

3.2 龍膽紫細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ǖ倪m用性
前期對(duì)顯微捕獲聯(lián)合LVPCR的研究發(fā)現(xiàn)： 3個(gè)新鮮口腔上皮細(xì)胞的檢測(cè)即可較穩(wěn)定的獲得13個(gè)位點(diǎn)以上的正確STR分型，其中部分檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、等位基因丟失等現(xiàn)象，這主要源于模板量極其微小，而LVPCR檢測(cè)方法的高靈敏也增加了隨機(jī)效應(yīng)的發(fā)生，例如：圖譜中出現(xiàn)無(wú)關(guān)等位基因或偽等位基因；雜合子等位基因不平衡擴(kuò)增，極度峰高不平衡導(dǎo)致等位基因丟失，將雜合子誤判為純合子等[19-20]。同時(shí)，，由于案例檢材中目的細(xì)胞數(shù)目極少，又受LVPCR技術(shù)的反應(yīng)體積限制及精細(xì)操作中難以避免的擴(kuò)增失敗影響，所以不能將所有細(xì)胞集中進(jìn)行擴(kuò)增。鑒于 3 個(gè)細(xì)胞的檢驗(yàn)效果已滿足圖譜疊加的要求，可通過(guò)復(fù)合獲得完整STR分型，達(dá)到同一認(rèn)定目的，所以實(shí)踐檢案中多采用3個(gè)細(xì)胞1組進(jìn)行LVPCR及DNA檢測(cè)。 本研究以不同樣本及同一樣本的 3 個(gè)口腔上皮細(xì)胞為模板，在染色及未染色條件下，進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示所有模板均獲得13個(gè)位點(diǎn)以上正確STR分型，雖然 2 種條件下各有部分圖譜出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增及等位基因丟失，但成功分型率無(wú)明顯差異（P>0.05）。提示龍膽紫細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ǖ囊�，并不加重更微量模板LVPCR 中非特異性擴(kuò)增、等位基因丟失現(xiàn)象，所得 DNA 檢驗(yàn)圖譜亦可通過(guò)疊加復(fù)合，達(dá)到同一認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。
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結(jié)   論

龍膽紫細(xì)胞懸液?jiǎn)稳痉ㄊ且环N適用于顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù)的細(xì)胞標(biāo)識(shí)方法，可一定程度降低目的細(xì)胞辨識(shí)難度，有助于提高該項(xiàng)技術(shù)中顯微捕獲儀平臺(tái)在法醫(yī)實(shí)踐檢案中的應(yīng)用效能，利于其推廣應(yīng)用。 
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本文編號(hào)：11665