為建立靈敏、快速、可視化的牛乳房炎金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP),根據(jù)GenBank公布的金黃色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列為靶序列,設(shè)計并合成一組特異性LAMP引物,分別優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,進(jìn)行特異性和靈敏度試驗,并用優(yōu)化后的方法對臨床分離的金黃色葡萄球菌樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,建立的方法可以在64℃反應(yīng)60 min,得到清晰的梯狀條帶;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10×SYBR GreenⅠ染色后,肉眼直接觀察或是紫外線照射之后均可判定結(jié)果;敏感性試驗表明,與常規(guī)PCR相比,該方法檢測到的金黃色葡萄球菌最低濃度為1×10～1 CFU/mL,靈敏度提高了100倍;該方法特異性良好,與大腸埃希菌、沙門菌、偽結(jié)核棒狀桿菌均無交叉反應(yīng);31份臨床分離的金黃色葡萄球菌樣本檢測的結(jié)果表明,該方法與傳統(tǒng)的PCR檢測結(jié)果一致。建立的LAMP檢測方法特異性、靈敏度良好,可用于臨床牛乳房炎金黃色葡萄球菌感染的檢測。

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【部分圖文】：

圖1 LAMP外引物驗證

使用沙門菌、大腸埃希菌和假結(jié)核棒狀桿菌作為對照,在優(yōu)化的條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明,僅在4號樣本(金黃色葡萄球菌)中可電泳出梯形特異性條帶(圖3),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)染色后于紫外燈下觀察,可見僅有4號樣本(金黃色葡萄球菌)出現(xiàn)綠色熒光,而其他擴(kuò)增產(chǎn)物則為橙色;日光下,陽性產(chǎn)物(金黃....

圖2 LAMP反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

圖1LAMP外引物驗證圖3金黃色葡萄球菌LAMP特異性試驗

圖3 金黃色葡萄球菌LAMP特異性試驗

圖2LAMP反應(yīng)體系及條件優(yōu)化2.4靈敏性試驗

圖4 金黃色葡萄球菌LAMP靈敏性試驗

應(yīng)用已經(jīng)建立的金色葡萄球菌LAMP檢測方法對31份奶牛乳房炎金色葡萄球菌菌液進(jìn)行檢測,并與常規(guī)PCR方法對比。結(jié)果顯示,兩者檢測到陽性樣品結(jié)果相同,表明LAMP與傳統(tǒng)PCR方法特異性一致。3討論

本文編號：4033081