發(fā)布時間：2025-02-09 19:07

　　Newbury-1 virus目前是杯狀病毒科（Caliciviridae family）紐布病毒屬（Nebovirus genus）唯一成員,常用Nebovirus（NeV）表述。NeV為單股正鏈RNA病毒,是致犢牛腹瀉的病毒。迄今為止,NeV已經(jīng)在美國、英國、巴西、土耳其、日本等12個國家檢出,具有廣泛的地域分布。根據(jù)RdRp基因序列,NeV可以分為NB-like、NA1-like和Dijon A216-like 3種基因型;根據(jù)完整VP1序列,NeV可以分為2種基因型（基因1型和基因2型）,其中基因1型又細分為4個譜系（譜系1～4）。目前,NeV在我國的存在及流行情況尚不清楚。本研究旨在調(diào)查NeV在我國的流行情況及其分子特征,取得了以下成果:1.我國部分地區(qū)奶牛NeV的分子檢測和基因組研究采集新疆維吾爾自治區(qū)、四川省、遼寧省、河南省、山東省和陜西省23個養(yǎng)殖場的307份奶牛糞便樣本（237份腹瀉糞便樣本,70份臨床健康糞便樣本）,采用RT-PCR方法對NeV進行檢測。結(jié)果顯示,NeV在腹瀉糞便樣本的檢出率（48.1%）顯著高于健康糞便樣本（5.70%,P<0.001）,場陽性...

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 Nebovirus的研究進展
    1.1 Nebovirus的發(fā)現(xiàn)及分類
    1.2 Nebovirus致病性
    1.3 Nebovirus的基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白
    1.4 RdRp的分子特征及功能
        1.4.1 RdRp的分子特征
        1.4.2 RdRp的結(jié)構(gòu)與功能
    1.5 VP1 的分子特征及功能
        1.5.1 VP1 的分子特征
        1.5.2 VP1 的結(jié)構(gòu)與功能
    1.6 Nebovirus的檢測技術(shù)
        1.6.1 電鏡觀察
        1.6.2 RT-PCR檢測
        1.6.3 基于酶聯(lián)免疫吸附試驗的抗體檢測技術(shù)
    1.7 Nebovirus的流行現(xiàn)狀
    1.8 問題與展望
第2章 我國部分地區(qū)奶牛Nebovirus的分子檢測和基因組研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 臨床樣本
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 病毒RNA的提取及cDNA的合成
        2.1.4 RT-PCR檢測Nebovirus
        2.1.5 與輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染
        2.1.6 Nebovirus完整VP1和Rd Rp基因片段的克隆
        2.1.7 Nebovirus完整基因組的克隆
        2.1.8 基因序列分析、遺傳進化和重組分析
        2.1.9 統(tǒng)計分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 Nebovirus RT-PCR檢測結(jié)果
        2.2.2 Nebovirus與輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染
        2.2.3 RdRp基因片段序列分析、遺傳進化及重組分析
        2.2.4 完整VP1 基因序列、遺傳進化及重組分析
        2.2.5 2 株奶牛Nebovirus完整基因組序列分析、遺傳進化及重組分析
    2.3 討論
        2.3.1 我國奶牛Nebovirus的流行情況
        2.3.2 我國奶牛Nebovirus RdRp分子特征
        2.3.3 Nebovirus VP1 的基因型和譜系
        2.3.4 我國奶牛Nebovirus VP1 分子特征
        2.3.5 我國奶牛Nebovirus基因組特征
    2.4 小結(jié)
第3章 牦牛Nebovirus分子檢測和基因組研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 臨床樣本
        3.1.2 主要試劑與儀器
        3.1.3 病毒RNA的提取及cDNA的合成
        3.1.4 RT-PCR檢測牦牛Nebovirus
        3.1.5 與輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染
        3.1.6 牦牛Nebovirus完整基因組的克隆
        3.1.7 RT-PCR方法篩選新型Nebovirus
        3.1.8 基因序列分析、遺傳進化和重組分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 牦牛Nebovirus的 RT-PCR檢測結(jié)果
        3.2.2 Nebovirus與輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染
        3.2.3 牦牛Nebovirus RdRp序列和遺傳進化分析
        3.2.4 2 株牦牛Nebovirus基因組的特征
        3.2.5 牦牛腹瀉樣本中新型Nebovirus的 RT-PCR檢測結(jié)果
    3.3 討論
        3.3.1 牦牛Nebovirus的流行情況
        3.3.2 新型Nebovirus的基因組特征
        3.3.3 VP1 新基因型的特征
        3.3.4 RdRp新基因型的特征
        3.3.5 新型Nebovirus的流行情況
    3.4 小結(jié)
第4章 檢測Nebovirus的 Real-time RT-PCR方法的建立
    4.1 材料與方法
        4.1.1 病毒(菌)株核酸和臨床樣本
        4.1.2 主要試劑及儀器
        4.1.3 引物的設計與合成
        4.1.4 核酸提取
        4.1.5 陽性標準品的制備
        4.1.6 反應體系及條件的優(yōu)化
        4.1.7 熔解曲線分析和標準曲線的建立
        4.1.8 特異性評價
        4.1.9 敏感性測定
        4.1.10 穩(wěn)定性評價
        4.1.11 4 種RT-PCR對臨床樣本中NeV核酸檢出率的比較
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 引物的特異性
        4.2.2 優(yōu)化的real-time RT-PCR反應體系及條件
        4.2.3 標準曲線及熔解曲線
        4.2.4 方法的特異性
        4.2.5 方法的敏感性
        4.2.6 方法的穩(wěn)定性
        4.2.7 4 種方法對臨床樣本的復核率
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點
參考文獻
附錄一
致謝



本文編號：4032726