發(fā)布時(shí)間：2025-02-08 19:53

　　H9N2亞型禽流感病毒的廣泛流行與頻繁的變異重組，不但對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且已經(jīng)威脅到了人類身體健康與生命安全。在1994年，我國從廣東地區(qū)分離得到第一株H9N2亞型禽流感病毒，此后，H9N2亞型禽流感病毒迅速向臨近省份蔓延。本研究在山東地區(qū)開展了H9N2亞型禽流感分子流行病學(xué)調(diào)查工作并研究了雞干擾素α和白介素18對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的抗病毒作用。 本研究對(duì)2012年實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的3株雞源H9N2亞型禽流感進(jìn)行生物學(xué)特性研究。3株病毒在SPF雞胚上增值一代后，其HA效價(jià)在2～7～2～9之間，EID50在10^-7.75/0.1mL～10^-8.5/0.1mL之間，TCID₅₀在10^-8.00/0.1mL¹0^-8.50/0.1mL之間。根據(jù)GenBank公布的H9N2亞型禽流感病毒（AIV）的全基因序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送測序公司測序，完成3株山東地方分離株CK/SD/SG/2012、CK/SD/JN/2012、C...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
Abstract
前言
    1.1 禽流感的研究概述
        1.1.1 禽流感病毒的組成和復(fù)制
        1.1.2 血凝素 HA 的功能
            1.1.2.1 HA 的裂解與流感致病性的關(guān)系
            1.1.2.2 受體結(jié)合與釋放的特異性
        1.1.3 神經(jīng)氨酸酶
        1.1.4 內(nèi)部基因的功能
            1.1.4.1 聚合酶蛋白
            1.1.4.2 核蛋白
            1.1.4.3 基質(zhì)蛋白
            1.1.4.4 非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.1.5 H9N2 亞型低致病性禽流感的流行現(xiàn)狀
    1.2 細(xì)胞因子概述
        1.2.1 干擾素的研究概述
        1.2.2 干擾素的命名及分類
        1.2.3 干擾素的基本特性
        1.2.4 干擾素的生物學(xué)活性
    1.3 白介素 18 的研究概述
        1.3.1 白介素18的生物學(xué)活性
    1.4 細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用
    1.5 細(xì)胞因子用于預(yù)防與治療的疾病潛力
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 毒株和質(zhì)粒
        2.1.2 細(xì)胞、受體菌與細(xì)胞培養(yǎng)基
        2.1.3 引物
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 培養(yǎng)基與主要試劑的配制方法
            2.1.5.1 各種培養(yǎng)基的配置
            2.1.5.2 瓊脂糖凝膠及電泳溶液
            2.1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)試劑及 SDS-PAGE 試劑的配制
        2.1.6 主要儀器
        2.1.7 SPF 雞胚
        2.1.8 分子生物學(xué)分析軟件
    2.2 方法
        2.2.1 雞源 H9N2 亞型禽流感病毒株的分離鑒定與純化
            2.2.1.1 樣品采集
            2.2.1.2 病毒分離
            2.2.1.3 病毒在 MDCK 細(xì)胞上的適應(yīng)和增殖
            2.2.1.4 病毒的純化
        2.2.2 H9N2 亞型禽流感分離株的生物學(xué)特性
            2.2.2.1 病毒在 SPF 雞胚中增殖的效價(jià)
            2.2.2.2 組織半數(shù)感染量的測定
            2.2.2.3 雞胚半數(shù)感染量的測定
        2.2.3 H9N2 亞型禽流感的序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析
            2.2.3.1 病毒 RNA 的提取
            2.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA
            2.2.3.3 PCR 擴(kuò)增各個(gè)基因片段
            2.2.3.4 PCR 產(chǎn)物鑒定與序列測序
            2.2.3.5 序列分析、核酸同源性比較、與進(jìn)化樹繪制
        2.2.4 雞干擾素α與白介素 18 共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
            2.2.4.1 信號(hào)肽引物設(shè)計(jì)
            2.2.4.2 雞干擾素α與白介素 18 的 PCR 擴(kuò)增與克隆
            2.2.4.3 雞干擾素α和白介素 18 基因的回收
            2.2.4.4 共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
            2.2.4.5 轉(zhuǎn)移載體 HBM-CIFN-α&CIL-18 的質(zhì)粒小提
            2.2.4.6 DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.4.7 重組質(zhì)粒 Bacmid 的構(gòu)建
            2.2.4.8 重組質(zhì)粒 Bacmid 的提取與鑒定
        2.2.5 重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染 sf9 昆蟲細(xì)胞及收獲重組桿狀病毒
            2.2.5.1 重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染 sf9 昆蟲細(xì)胞
            2.2.5.2 重組桿狀病毒的 DNA 的提取與 PCR 鑒定
            2.2.5.3 間接免疫熒光檢測干擾素α和白介素 18 的共表達(dá)
            2.2.5.4 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測雞干擾素α和白介素 18 的共表達(dá)
            2.2.5.5 雞干擾素α和白介素 18 共表達(dá)產(chǎn)物在 MDCK 細(xì)胞上對(duì) H9N2 禽流感病毒的抑制作用
3 結(jié)果與分析
    3.1.1 對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室 2012 年送檢病料統(tǒng)計(jì)結(jié)果
    3.1.2 H9N2 亞型禽流感病毒的分離與純化
    3.1.3 H9N2 亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性
    3.1.4 H9N2 亞型禽流感毒株的全基因測序與系統(tǒng)進(jìn)化分析
    3.1.5 基因概況和系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.1 HA 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.2 NA 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.3 M 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.4 NS 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.5 PB2 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.6 PB1 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.7 PA 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.8 NP 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.5.9 全基因組分析
    3.2.1 雞干擾素α及白介素 18 融合蜂素信號(hào)肽成熟蛋白的擴(kuò)增
    3.2.2 共表達(dá)載體的酶切鑒定及重組桿狀病毒 PCR 結(jié)果
    3.3.1 間接免疫熒光檢測雞干擾素α和白介素 18 的共表達(dá)
    3.3.2 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測雞干擾素α和白介素 18 的表達(dá)
    3.3.3 雞干擾素α和白介素 18 對(duì) H9N2 亞型禽流感病毒的抗病毒作用
4 討論
    4.1 H9N2 禽流感分離株的基本生物學(xué)特性及基因序列分析
    4.2 干擾素α與白介素 18 共表達(dá)及對(duì) H9N2 亞型禽流感病毒的抗病毒作用
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介及論文發(fā)表情況



本文編號(hào)：4031898