發(fā)布時間：2025-01-14 07:08

　　細(xì)胞間隙連接(gap junction)由若干連接蛋白構(gòu)成,在毛囊生長發(fā)育的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到十分重要的作用。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序方法得到的絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期差異表達(dá)的基因中,連接蛋白40(Connexin40, Cx40)和連接蛋白43(Connexin43, Cx43)的表達(dá)存在明顯差異。本研究選取Cx40和Cx43基因作為研究對象,探討兩種基因是否在絨山羊毛囊生長發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用,從而為進(jìn)一步研究絨山羊毛囊生長發(fā)育的基因調(diào)控系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究成功分離得到了絨山羊初級毛乳頭細(xì)胞、次級毛乳頭細(xì)胞和表皮細(xì)胞,并分析了這3種細(xì)胞中Cx40和Cx43基因的表達(dá)情況；同時,通過進(jìn)一步對絨山羊皮膚進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),Cx40和Cx43基因在絨山羊皮膚毛囊生長期轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著高于靜息期。 通過RT-PCR技術(shù)成功克隆了Cx40和Cx43基因的CDS序列；將兩段序列分別插入到了真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中,成功構(gòu)建了pIRES2-EGFP-Cx40載體和pIRES2-EGFP-Cx43載體；將上述兩種載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法對絨山羊初級毛...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
縮略詞表
第一部分 實(shí)驗(yàn)研究
    第一章 Cx40和Cx43基因在絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞及皮膚毛囊周期性變化的表達(dá)驗(yàn)證
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要儀器設(shè)備
                2.2.1 分子實(shí)驗(yàn)所用
                2.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用
            2.3 主要試劑及耗材
                2.3.1 分子實(shí)驗(yàn)所用
                2.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用
        3 方法
            3.1 分離及培養(yǎng)三種絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞
                3.1.1 分離及培養(yǎng)初級毛乳頭細(xì)胞
                3.1.2 分離及培養(yǎng)次級毛乳頭細(xì)胞
                3.1.3 分離及培養(yǎng)表皮細(xì)胞
            3.2 驗(yàn)證三種絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞Cx40和Cx43基因的表達(dá)
                3.2.1 獲取三種絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞總cDNA
                3.2.2 設(shè)計Cx40和Cx43基因CDS序列PCR擴(kuò)增引物
                3.2.3 檢測三種絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞Cx40和Cx43基因表達(dá)情況
            3.3 驗(yàn)證Cx40和Cx43基因在絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期的差異表達(dá)
                3.3.1 獲取絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期的皮樣總cDNA
                3.3.2 設(shè)計Cx40和Cx43基因及GAPDH內(nèi)參基因CDS序列qPCR擴(kuò)增引物
                3.3.3 檢測Cx40和Cx43基因及GAPDH內(nèi)參基因CDS序列qPCR擴(kuò)增引物的特異性
                3.3.4 檢測絨山羊皮膚毛囊兩個時期皮樣Cx40和Cx43基因的相對表達(dá)量
        4 結(jié)果
            4.1 分離及培養(yǎng)三種絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞的結(jié)果
                4.1.1 分離及培養(yǎng)初級毛乳頭細(xì)胞的結(jié)果
                4.1.2 分離及培養(yǎng)次級毛乳頭細(xì)胞的結(jié)果
                4.1.3 分離及培養(yǎng)表皮細(xì)胞的結(jié)果
            4.2 驗(yàn)證三種絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞Cx40和Cx43基因的表達(dá)的結(jié)果
            4.3 驗(yàn)證Cx40和Cx43基因在絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期的差異表達(dá)的結(jié)果
        5 討論
        參考文獻(xiàn)
    第二章 Cx40和Cx43基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及絨山羊毛囊相關(guān)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要儀器設(shè)備
                2.2.1 分子實(shí)驗(yàn)所用
                2.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用
            2.3 主要試劑及耗材
                2.3.1 分子實(shí)驗(yàn)所用
                2.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用
        3 方法
            3.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列
                3.1.1 獲取絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞總cDNA
                3.1.2 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列
                3.1.3 檢測Cx40和Cx43基因CDS序列克隆結(jié)果
            3.2 構(gòu)建插入Cx40和Cx43基因CDS序列的轉(zhuǎn)染載體
                3.2.1 構(gòu)建pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43載體
                3.2.2 檢測pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43載體構(gòu)建結(jié)果
            3.3 篩選轉(zhuǎn)Cx40和Cx43基因的細(xì)胞系
            3.4 檢測轉(zhuǎn)Cx40和Cx43基因的細(xì)胞系
                3.4.1 獲取6種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和3種非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系總cDNA
                3.4.2 設(shè)計Cx40和Cx43基因CDS序列qPCR擴(kuò)增引物
                3.4.3 檢測Cx40和Cx43基因CDS序列qPCR擴(kuò)增引物的特異性
                3.4.4 檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系Cx40和Cx43基因的相對表達(dá)量
        4 結(jié)果
            4.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列的結(jié)果
            4.2 構(gòu)建插入Cx40和Cx43基因CDS序列的載體的結(jié)果
            4.3 篩選轉(zhuǎn)Cx40和Cx43基因的細(xì)胞系的結(jié)果
            4.4 檢測轉(zhuǎn)Cx40和Cx43基因的細(xì)胞系的結(jié)果
        5 討論
            5.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列的條件優(yōu)化
            5.2 構(gòu)建pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43載體的條件優(yōu)選
            5.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式的選擇及優(yōu)化
            5.4 轉(zhuǎn)Cx40和Cx43轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的檢測分析
        參考文獻(xiàn)
    第三章 Cx40和Cx43基因過表達(dá)對參與絨山羊毛囊生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)影響的檢測
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要儀器設(shè)備
            2.3 主要試劑及耗材
        3 方法
            3.1 設(shè)計檢測對照組及被檢測基因CDS序列qPCR擴(kuò)增引物
            3.2 檢測絨山羊毛囊生長發(fā)育相關(guān)基因CDS序列qPCR擴(kuò)增引物的特異性
            3.3 檢測6種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系絨山羊毛囊生長發(fā)育相關(guān)基因的相對表達(dá)量
        4 結(jié)果
            4.1 基因VEGF轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況
            4.2 基因IGF-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況
            4.3 基因β-catenin轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況
            4.4 基因HIF-1α轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況
            4.5 基因胸腺素β4轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況
        5 討論
            5.1 關(guān)于基因VEGF的差異表達(dá)
            5.2 關(guān)于基因IGF-1的差異表達(dá)
            5.3 關(guān)于基因β-catenin的差異表達(dá)
            5.4 關(guān)于基因HIF-1α的差異表達(dá)
            5.5 關(guān)于基因胸腺素β4的差異表達(dá)
        參考文獻(xiàn)
結(jié)論
圖版1
圖版2
附錄
文獻(xiàn)綜述 細(xì)胞間隙連接(gapjunction,GJ)的研究進(jìn)展
    1 結(jié)構(gòu)組成
    2 功能調(diào)節(jié)
        2.1 電偶聯(lián)信號傳遞作用
        2.2 代謝偶聯(lián)信號傳遞作用
        2.3 調(diào)控作用
    3 研究方法
        3.1 細(xì)胞生物學(xué)的研究方法
        3.2 分子生物學(xué)的研究方法
    4 與人類疾病的聯(lián)系
        4.1 與先天耳聾疾病的聯(lián)系
        4.2 與心臟疾病的聯(lián)系
        4.3 與腫瘤疾病的聯(lián)系
    5 展望
    參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間論文發(fā)表情況



本文編號：4026588