細胞間隙連接(gap junction)由若干連接蛋白構成,在毛囊生長發(fā)育的細胞信號轉導過程中起到十分重要的作用。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),通過高通量轉錄組測序方法得到的絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期差異表達的基因中,連接蛋白40(Connexin40, Cx40)和連接蛋白43(Connexin43, Cx43)的表達存在明顯差異。本研究選取Cx40和Cx43基因作為研究對象,探討兩種基因是否在絨山羊毛囊生長發(fā)育中起到重要的調控作用,從而為進一步研究絨山羊毛囊生長發(fā)育的基因調控系統(tǒng)提供實驗依據(jù)。 本研究成功分離得到了絨山羊初級毛乳頭細胞、次級毛乳頭細胞和表皮細胞,并分析了這3種細胞中Cx40和Cx43基因的表達情況；同時,通過進一步對絨山羊皮膚進行檢測發(fā)現(xiàn),Cx40和Cx43基因在絨山羊皮膚毛囊生長期轉錄表達水平顯著高于靜息期。 通過RT-PCR技術成功克隆了Cx40和Cx43基因的CDS序列；將兩段序列分別插入到了真核表達載體pIRES2-EGFP中,成功構建了pIRES2-EGFP-Cx40載體和pIRES2-EGFP-Cx43載體；將上述兩種載體通過脂質體轉染的方法對絨山羊初級毛...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
縮略詞表
第一部分 實驗研究
    第一章 Cx40和Cx43基因在絨山羊毛囊相關細胞及皮膚毛囊周期性變化的表達驗證
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要儀器設備
                2.2.1 分子實驗所用
                2.2.2 細胞實驗所用
            2.3 主要試劑及耗材
                2.3.1 分子實驗所用
                2.3.2 細胞實驗所用
        3 方法
            3.1 分離及培養(yǎng)三種絨山羊毛囊相關細胞
                3.1.1 分離及培養(yǎng)初級毛乳頭細胞
                3.1.2 分離及培養(yǎng)次級毛乳頭細胞
                3.1.3 分離及培養(yǎng)表皮細胞
            3.2 驗證三種絨山羊毛囊相關細胞Cx40和Cx43基因的表達
                3.2.1 獲取三種絨山羊毛囊相關細胞總cDNA
                3.2.2 設計Cx40和Cx43基因CDS序列PCR擴增引物
                3.2.3 檢測三種絨山羊毛囊相關細胞Cx40和Cx43基因表達情況
            3.3 驗證Cx40和Cx43基因在絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期的差異表達
                3.3.1 獲取絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期的皮樣總cDNA
                3.3.2 設計Cx40和Cx43基因及GAPDH內參基因CDS序列qPCR擴增引物
                3.3.3 檢測Cx40和Cx43基因及GAPDH內參基因CDS序列qPCR擴增引物的特異性
                3.3.4 檢測絨山羊皮膚毛囊兩個時期皮樣Cx40和Cx43基因的相對表達量
        4 結果
            4.1 分離及培養(yǎng)三種絨山羊毛囊相關細胞的結果
                4.1.1 分離及培養(yǎng)初級毛乳頭細胞的結果
                4.1.2 分離及培養(yǎng)次級毛乳頭細胞的結果
                4.1.3 分離及培養(yǎng)表皮細胞的結果
            4.2 驗證三種絨山羊毛囊相關細胞Cx40和Cx43基因的表達的結果
            4.3 驗證Cx40和Cx43基因在絨山羊皮膚毛囊靜息期和生長期的差異表達的結果
        5 討論
        參考文獻
    第二章 Cx40和Cx43基因真核表達載體的構建及絨山羊毛囊相關細胞的轉染
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要儀器設備
                2.2.1 分子實驗所用
                2.2.2 細胞實驗所用
            2.3 主要試劑及耗材
                2.3.1 分子實驗所用
                2.3.2 細胞實驗所用
        3 方法
            3.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列
                3.1.1 獲取絨山羊胎兒成纖維細胞總cDNA
                3.1.2 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列
                3.1.3 檢測Cx40和Cx43基因CDS序列克隆結果
            3.2 構建插入Cx40和Cx43基因CDS序列的轉染載體
                3.2.1 構建pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43載體
                3.2.2 檢測pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43載體構建結果
            3.3 篩選轉Cx40和Cx43基因的細胞系
            3.4 檢測轉Cx40和Cx43基因的細胞系
                3.4.1 獲取6種轉基因細胞系和3種非轉基因細胞系總cDNA
                3.4.2 設計Cx40和Cx43基因CDS序列qPCR擴增引物
                3.4.3 檢測Cx40和Cx43基因CDS序列qPCR擴增引物的特異性
                3.4.4 檢測轉基因細胞系與非轉基因細胞系Cx40和Cx43基因的相對表達量
        4 結果
            4.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列的結果
            4.2 構建插入Cx40和Cx43基因CDS序列的載體的結果
            4.3 篩選轉Cx40和Cx43基因的細胞系的結果
            4.4 檢測轉Cx40和Cx43基因的細胞系的結果
        5 討論
            5.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列的條件優(yōu)化
            5.2 構建pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43載體的條件優(yōu)選
            5.3 細胞轉染方式的選擇及優(yōu)化
            5.4 轉Cx40和Cx43轉基因細胞系的檢測分析
        參考文獻
    第三章 Cx40和Cx43基因過表達對參與絨山羊毛囊生長發(fā)育相關基因表達影響的檢測
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要儀器設備
            2.3 主要試劑及耗材
        3 方法
            3.1 設計檢測對照組及被檢測基因CDS序列qPCR擴增引物
            3.2 檢測絨山羊毛囊生長發(fā)育相關基因CDS序列qPCR擴增引物的特異性
            3.3 檢測6種轉基因細胞系與非轉基因細胞系絨山羊毛囊生長發(fā)育相關基因的相對表達量
        4 結果
            4.1 基因VEGF轉錄表達情況
            4.2 基因IGF-1轉錄表達情況
            4.3 基因β-catenin轉錄表達情況
            4.4 基因HIF-1α轉錄表達情況
            4.5 基因胸腺素β4轉錄表達情況
        5 討論
            5.1 關于基因VEGF的差異表達
            5.2 關于基因IGF-1的差異表達
            5.3 關于基因β-catenin的差異表達
            5.4 關于基因HIF-1α的差異表達
            5.5 關于基因胸腺素β4的差異表達
        參考文獻
結論
圖版1
圖版2
附錄
文獻綜述 細胞間隙連接(gapjunction,GJ)的研究進展
    1 結構組成
    2 功能調節(jié)
        2.1 電偶聯(lián)信號傳遞作用
        2.2 代謝偶聯(lián)信號傳遞作用
        2.3 調控作用
    3 研究方法
        3.1 細胞生物學的研究方法
        3.2 分子生物學的研究方法
    4 與人類疾病的聯(lián)系
        4.1 與先天耳聾疾病的聯(lián)系
        4.2 與心臟疾病的聯(lián)系
        4.3 與腫瘤疾病的聯(lián)系
    5 展望
    參考文獻
致謝
碩士期間論文發(fā)表情況



本文編號：4026588