豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是一種無囊膜包裹的單鏈環(huán)狀DNA病毒,其是引起斷奶仔豬衰竭綜合征的主要病原。有研究表明,在PCV2感染豬肺泡巨噬細胞內(nèi),PCV2 Cap通過與宿主蛋白gC1qR相互作用,激活PI3K/Akt和p38 MAPK信號通路,進而顯著促進巨噬細胞中的白介素-10(interleukin-10,IL-10)生成。但是gC1qR在PCV2的體內(nèi)復制及其導致的病理變化有何種作用?目前并不清楚。本試驗擬通過構(gòu)建靶向于豬gC1qR基因的CRISPR/Cas9重組慢病毒系統(tǒng),將其感染仔豬后獲得部分組織gC1qR基因敲除的仔豬,以PCV2感染部分組織gC1qR基因敲除的仔豬,復制PCV2感染豬模型,闡明gC1qR缺失對PCV2體內(nèi)復制和誘導病理變化的影響。研究取得以下實驗結(jié)果:1.本試驗利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),設(shè)計了3個靶向于豬gC1qR基因的gRNA(g113、g229和g246),分別成功構(gòu)建了3個重組慢病毒rLenti-113、r Lenti-229和rLenti-246,將構(gòu)建好的慢病毒感染...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻綜述
    第一章 PCV2 Cap蛋白及其相互作用分子研究進展
        1.1 PCV2病原學特征
        1.2 Cap蛋白分子特征
        1.3 Cap蛋白在PCV2病毒復制和致病中的作用
            1.3.1 Cap蛋白在PCV2病毒復制中的作用
            1.3.2 Cap蛋白在PCV2致病中的作用
        1.4 Cap蛋白相互作用的細胞蛋白及其功能
            1.4.1 gC1qR蛋白及其功能
            1.4.2 其他5種相互蛋白及其功能
    第二章 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究進展
        2.1 基因編輯技術(shù)概況
        2.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)原理及研究概況
        2.3 本研究的目的和意義
試驗研究
    第三章 靶向于豬gClqR基因的CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定
        3.1 試劑材料
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器
            3.1.3 主要試劑的配制
        3.2 方法
            3.2.1 載體的構(gòu)建
            3.2.2 慢病毒的包裝
            3.2.3 相對定量標準曲線的建立
            3.2.4 慢病毒滴度的測定
            3.2.5 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細胞
            3.2.6 western blotting檢測
            3.2.7 測序鑒定
        3.3 結(jié)果與分析
            3.3.1 gC1qR基因敲除位點的確定
            3.3.2 雙酶切鑒定
            3.3.3 標準曲線及慢病毒滴度測定
            3.3.4 慢病毒感染PK-15 細胞的篩選
            3.3.5 western blotting檢測gC1qR基因敲除情況
            3.3.6 測序
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 gC1qR基因缺失對PCV2感染豬組織病變的影響
        4.1 試劑材料
            4.1.1 主要試劑
            4.1.2 主要儀器
            4.1.3 主要試劑的配制
        4.2 方法
            4.2.1 動物試驗分組
            4.2.2 試驗動物病原檢測
            4.2.3 CRISPR/Cas9慢病毒感染構(gòu)建部分肺組織gC1qR-/-仔豬
            4.2.4 PCV2感染豬模型的構(gòu)建
            4.2.5 gC1qR缺失對PCV2在機體內(nèi)復制的影響
            4.2.6 石蠟切片的制作
            4.2.7 免疫組織化學染色
            4.2.8 HE染色
        4.3 結(jié)果與分析
            4.3.1 濃縮慢病毒后拷貝數(shù)測定
            4.3.2 仔豬病原學檢測
            4.3.3 慢病毒感染仔豬的體溫和體重變化
            4.3.4 仔豬組織中g(shù)C1qR基因敲除鑒定
            4.3.5 組織部分缺失gC1qR對PCV2復制及所致病理變化的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點
參考文獻
主要縮略詞和中英文對照表
致謝
作者簡介



本文編號：4020675