以決定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因節(jié)段(Seg-2)為檢測(cè)靶基因,設(shè)計(jì)7對(duì)特異性引物,建立用于鑒定EHDV血清型的RT-PCR檢測(cè)方法,并通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序,進(jìn)一步了解病毒Seg-2的遺傳特性。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該檢測(cè)方法可準(zhǔn)確鑒定不同血清型的EHDV毒株,與藍(lán)舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均無(wú)交叉反應(yīng);靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)不同血清型EHDV核酸的檢測(cè)下限均可達(dá)10～2拷貝;對(duì)我國(guó)不同時(shí)間與不同地域分離的EHDV毒株進(jìn)行血清型RT-PCR鑒定,結(jié)果顯示分離的31株EHDV分屬EHDV-1、-5、-6、-7與-10型等5種血清型,與血清中和試驗(yàn)的鑒定結(jié)果完全吻合。以上結(jié)果表明,該方法具有良好的特異性和較高的靈敏度,可快速準(zhǔn)確地鑒定EHDV毒株的血清型。

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圖1 不同血清型EHDV PCR檢測(cè)結(jié)果

取不同血清型EHDV代表毒株(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10血清型毒株)cDNA為模板,用對(duì)應(yīng)的血清型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)每種血清型均設(shè)立陰性對(duì)照。結(jié)果顯示7種血清型EHDVSeg-2的擴(kuò)增產(chǎn)物大小在800～1200bp,每種血清型陰性對(duì)照(N....

圖2 EHDV血清型引物特異性檢測(cè)

以BTV、AKAV、CHUV和7種血清型EHDV(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10)的cDNA為模板,分別使用表2中不同血清型EHDV鑒定引物(P1～P10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均設(shè)立陰性對(duì)照,分析引物的特異性。結(jié)果顯示:EHDV血清型RT-PCR引物僅與對(duì)應(yīng)血清型....

圖3 EHDV血清型引物靈敏度檢測(cè)

通過(guò)絕對(duì)定量qPCR計(jì)算出EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10不同血清型EHDV代表毒株的cDNA拷貝數(shù)分別為1.1×109、1.4×1010、1.2×1011、3.6×1010、2.4×1010、8.7×108和2.....

圖4 基于NJ法的EHDV 參考毒株和中國(guó)毒株Seg-2序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

目前血清中和試驗(yàn)是國(guó)際上血清檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但該方法有操作要求高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和必須獲得血清型完整的標(biāo)準(zhǔn)毒株或血清等缺點(diǎn),不利于EHDV血清型的快速鑒定。而病毒核酸的分子檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)樣本量多、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于各類疾病的快速診斷及血清型鑒定等方面。本研究以我國(guó)....

本文編號(hào)：4020382