大腸桿菌是溫血動物包括人在內(nèi)的腸道中的正常菌群之一,大部分為非致病性菌株,少數(shù)則具有致病性。致病性大腸桿菌可分為腸道致病性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC)兩大類,禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic E.coli, APEC)屬于ExPEC的成員,定植于腸道外,可以引發(fā)禽的局部感染或全身感染性疾病-大腸桿菌病。禽大腸桿菌病已成為最嚴重的細菌性傳染病之一,給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。已發(fā)現(xiàn)APEC擁有多種致病因子,并且還有新的致病因子在不斷地被發(fā)現(xiàn)被研究�；蛲蛔兪茄芯炕蚬δ艿闹匾夹g(shù)手段�？寡趸烙到y(tǒng)是細菌保護自身免受代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物損傷的一種保護性機制,ahpF基因就是抗氧化防御系統(tǒng)中的一員,它與ahpC一起作用將內(nèi)源性H202催化成相應(yīng)的醇和H20,從而清除代謝過程中產(chǎn)生的H2O2,以減少對細菌自身的傷害。另一個研究的基因yfgC和細菌的外膜蛋白保持著緊密的聯(lián)系,它可以降解錯誤折疊的外膜蛋白,對細菌外膜蛋白的完整性起到重要的作用。但是目前來說,它的具體作用機制尚不清楚。本研究旨在研究ahpF, yfgC基因與APEC致病性之間的關(guān)系,為揭示...

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
第一章 文獻綜述
    一 關(guān)于禽大腸桿菌的研究進展
        1 禽大腸桿菌概述
            1.1 禽大腸桿菌病的臨床癥狀
            1.2 禽致病性大腸桿菌病的流行特點和防治措施
        2 大腸桿菌的血清型
        3 禽致病性大腸桿菌的主要毒力因子
            3.1 抗血清活性因子
            3.2 黏附素(Adhesin)
            3.3 鐵攝取系統(tǒng)
            3.4 溫度敏感性血凝素(TSH)
            3.5 志賀毒素
        4 目的基因的研究背景
            4.1 ahpF的研究背景
            4.2 yfgC的研究背景
    二 兩種突變技術(shù)的研究進展
        1 Red重組技術(shù)的研究進展
            1.1 Red重組系統(tǒng)的組成
            1.2 Red同源重組相關(guān)質(zhì)粒的介紹
            1.3 Red同源重組系統(tǒng)的發(fā)展趨勢
        2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究進展
            2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
            2.2 CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)
            2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的機制
            2.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建突變株
第二章 λRed重組和CRISPR/Cas技術(shù)在構(gòu)建禽病原性大腸桿菌ahpF、yfgC基因突變株中的運用
    1 材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 分子生物學(xué)及數(shù)據(jù)分析軟件
        1.5 試驗動物
    2 用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建ahpF、yfgC突變株
        2.1 質(zhì)粒pMD-T-ahpF-Cat、pMD-T-yfgC-Cat重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 E058ΔahpF-1、E058ΔyfgC-1突變株的構(gòu)建
        2.3 突變株抗性基因的去除
    3 用CRISPR/Cas重組系統(tǒng)構(gòu)建ahpF、yfgC突變株
        3.1 gRNA的設(shè)計
        3.2 CRISPR/Cas突變株的構(gòu)建
        3.3 質(zhì)粒的消除
    4 突變株生物學(xué)特性的研究
        4.1 生長曲線的測定
        4.2 SPF雞血清殺菌試驗
        4.3 體外競爭試驗
        4.4 基因組DNA去除鑒定和cDNA的PCR鑒定
    5 突變株的回復(fù)拯救實驗
        5.1 ahpF回復(fù)基因片段的擴增
        5.2 yfgC回復(fù)基因片段的擴增
        5.3 重組質(zhì)粒pACYC184-ahpF、pACYC184-yfgC的構(gòu)建
        5.4 電轉(zhuǎn)化E058ΔahpF和E058ΔyfgC有抗突變株獲得其回復(fù)拯救株
    6 突變菌株的致病性實驗
        6.1 半數(shù)致死量(LD₅₀)試驗
        6.2 體內(nèi)動態(tài)分布試驗
    7 結(jié)果
        7.1 質(zhì)粒pMD-T-ahpF-Cat、pMD-T-yfgC-Cat片段的鑒定結(jié)果
        7.2 重疊PCR片段的鑒定
        7.3 構(gòu)建的突變株的鑒定
        7.4 RT-PCR結(jié)果
        7.5 突變株的回復(fù)拯救結(jié)果
        7.6 突變株生物學(xué)特性的研究結(jié)果
    8 討論
全文總結(jié)
參考文獻
致謝



本文編號：4022086