柔嫩艾美耳球蟲是七種雞球蟲中致病力最強的蟲種之一，寄生于盲腸中，危害十分嚴重。蟲體頂復合器中含有多種具有分泌功能的細胞器。其中，微線細胞器分泌的EtMIC1和EtMIC2蛋白在蟲體粘附、入侵宿主細胞時起重要作用。目前研究表明EtMIC1、EtMIC2蛋白具有較好的免疫保護力，相關(guān)報道稱EtMIC1、EtMIC2蛋白在球蟲發(fā)育階段的早期表達，但在其內(nèi)生性發(fā)育的后期是否表達目前尚無報道。為了研究微線蛋白EtMIC1、EtMIC2在球蟲整個內(nèi)生性發(fā)育階段表達的動態(tài)變化，本研究進行了以下工作： 1.單克隆抗體的制備 克隆了EtMIC1、EtMIC2基因，利用原核表達的EtMIC1、EtMIC2蛋白和本實驗室保存的真核蛋白EtMIC1、EtMIC2免疫BALB/c小鼠。免疫的BALB/c小鼠抗體效價達到單克隆抗體制備的標準后，經(jīng)細胞融合、間接ELISA篩選、兩次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞。擴大培養(yǎng)收集細胞培養(yǎng)上清離心后作為單克隆抗體。結(jié)果得到了3組單克隆抗體�？笶tMIC1原核蛋白的單克隆抗體：1-H2；抗EtMIC1真核蛋白的單克隆抗體：1-A1、1-C4；抗EtMIC...

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【學位級別】：碩士

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Abstract
1 引言
    1.1 雞球蟲病的危害
    1.2 雞球蟲病原特性
    1.3 球蟲的免疫原性
    1.4 柔嫩艾美耳球蟲微線及微線蛋白
    1.5 柔嫩艾美爾球蟲 EtMIC-1 和 EtMIC-2 研究進展
    1.6 柔嫩艾美耳球蟲內(nèi)生性發(fā)育不同階段的劃分
    1.7 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 蟲種及細胞
        2.1.2 試驗動物
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 質(zhì)粒及受體菌
        2.1.5 主要設(shè)備及儀器
    2.2 方法
        2.2.1 主要試劑配制
        2.2.2 EtMIC1 和 EtMIC2 的克隆構(gòu)建與原核表達
        2.2.3 EtMic1 和 EtMic2 重組蛋白的表達和純化
        2.2.4 EtMic1 和 EtMic2 蛋白單克隆抗體的制備
        2.2.5 EtMic1 和 EtMic2 蛋白單克隆抗體的鑒定與應用
3 結(jié)果與分析
    3.1 EtMIC1 和 EtMIC2 基因的克隆
        3.1.1 EtMIC1 和 EtMIC2 基因片段的 PCR 擴增
        3.1.2 pET-30a (+)-EtMIC1 和 pET-30a (+)-EtMIC2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 top10 后菌落 PCR 結(jié)果
        3.1.3 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
    3.2 EtMIC1 和 EtMIC2 基因的表達與蛋白純化
        3.2.1 EtMIC1 和 EtMIC2 基因的表達與蛋白純化
        3.2.2 原核表達 EtMIC1 和 EtMIC2 蛋白的濃度測定
    3.3 EtMIC1 和 EtMIC2 蛋白單克隆抗體的制備
        3.3.1 小鼠血清抗體效價的測定
        3.3.2 雜交瘤細胞的篩選
    3.4 單克隆抗體的鑒定
        3.4.1 單克隆抗體效價的測定
        3.4.2 單克隆抗體的亞型鑒定
        3.4.3 單克隆抗體的特異性鑒定
    3.5 EtMIC1 和 EtMIC2 蛋白在球蟲內(nèi)生性發(fā)育階段表達的動態(tài)變化
        3.5.1 單抗檢測
        3.5.2 Western blot 檢測
4 討論
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 致謝
8 碩士期間論文發(fā)表情況



本文編號：4020409