建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)感染雞動物模型,收集獲得E. tenella第2代裂殖子,通過PCR擴(kuò)增E. tenella第2代裂殖子絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶5(serine/threonine protein phosphatase type 5,Et PP5)基因編碼序列,構(gòu)建pET-28a-Et PP5表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,鎳親和層析柱法純化表達(dá)蛋白并免疫BABL/c小鼠制備Et PP5抗血清。采用免疫熒光和Western-blot技術(shù)檢測第2代裂殖子Et PP5蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,30℃時,用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)pET-28a-Et PP5表達(dá)的融合蛋白大多以包涵體形式存在。Et PP5主要分布在E. tenella第2代裂殖子的細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核也有少量分布。經(jīng)地克珠利處理后,E. tenella第2代裂殖子Et PP5蛋白表達(dá)降低了47.65%(P<0.01)。提示,地克珠利可能通過作用Et PP5發(fā)揮抗球蟲作用,這為地克珠利抗球蟲作用機(jī)理的闡述提供了理論依據(jù)。

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圖5 Et PP5免疫熒光定位分析

圖4E.tenella第2代裂殖子EtPP5蛋白表達(dá)的Western-blot檢測此外，PP5還充當(dāng)著凋亡的生理抑制劑[15]。細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosissignal-regulatingkinase1,ASK1）是MAPK家族成員之一，多種應(yīng)激損傷和促....

圖1 Et PP5目的基因的PCR產(chǎn)物

以pMD-EtPP5為模板，PCR擴(kuò)增EtPP5基因ORF序列，序列大小為1647bp（圖1）。膠回收的PCR產(chǎn)物與pET-28a（+）載體經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，測序分析獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EtP....

圖2 Et PP5原核表達(dá)蛋白的電泳分析

將pET-28a-EtPP5轉(zhuǎn)化BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，接種到含有Kana抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至D600值達(dá)0.4～0.6左右，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果（圖2）顯示，30℃誘導(dǎo)后第1～9小時均有蛋白表達(dá)，大小約為60.82ku，蛋白主要以包涵體形....

圖3 鎳親和層析法進(jìn)行蛋白的純化

圖2EtPP5原核表達(dá)蛋白的電泳分析2.3EtPP5蛋白表達(dá)的Western-blot分析

本文編號：4017508