近年來(lái)，禽流感的暴發(fā)與流行給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的危害。2003年12月9日，香港發(fā)生H9N2亞型禽流感疫情，H9N2亞型為低致病性禽流感病毒，但是因?yàn)樗鼈鞑V泛，而且同樣可引起人和動(dòng)物致病，甚至引起疫病的暴發(fā)和流行，其危害不容忽視，做好禽流感的診斷與監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。更為重要的是禽流感病毒亞型眾多且變異性強(qiáng)，給檢測(cè)帶來(lái)了很大困難。 禽流感病毒蛋白質(zhì)含有5種多肽，即血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)蛋白、核蛋白和多聚酶。血凝素是流感病毒的主要表面糖蛋白，具有凝集多種動(dòng)物紅細(xì)胞的性質(zhì)，借助HA對(duì)細(xì)胞受體的作用，使病毒粘附于細(xì)胞，在穿膜過(guò)程中起關(guān)鍵作用。HA的變異性很強(qiáng)，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因。HA具有誘生中和抗體的能力，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，因此血凝素在禽流感的診斷和防治中起重要作用，成為禽流感的研究熱點(diǎn)。 本課題起初是以禽流感HA基因?yàn)榘悬c(diǎn)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。我們首先通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增了H9N2亞型禽流感病毒的HA基因并克隆插入到真核質(zhì)粒pcDNA3.1-A中，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-A-HA。將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CEF，鑒定其在CEF上的表達(dá)。同...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 禽流感概述
        1.1.1 禽流感的流行病學(xué)特點(diǎn)
        1.1.2 禽流感的主要癥狀和病變
        1.1.3 診斷
        1.1.4 鑒別診斷
        1.1.5 治療
        1.1.6 預(yù)防
    1.2 禽流感病毒
        1.2.1 禽流感病毒的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 禽流感病毒的分類(lèi)與命名
        1.2.3 流感病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白
        1.2.4 流感病毒的復(fù)制
        1.2.5 禽流感病毒抗原性的改變
        1.2.6 流感病毒的理化特性
    1.3 HA 基因特點(diǎn)
        1.3.1 HA 基因序列
        1.3.2 HA 編碼的蛋白質(zhì)
        1.3.3 HA 蛋白的生物學(xué)功能
    1.4 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基的試劑
        2.1.4 動(dòng)物和細(xì)胞
        2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)材料
        2.1.6 轉(zhuǎn)染試劑
        2.1.7 其它試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 主要溶液的配制
        2.2.2 禽流感 HA 基因的釣取
        2.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒在 CEF 上的表達(dá)
        2.2.5 HA 基因上、中、下段克隆載體的構(gòu)建
        2.2.6 HA 基因上、中、下段原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.8 western blot
        2.2.9 重組蛋白的可溶性分析
        2.2.10 重組原核表達(dá)載體 HA 蛋白的大量表達(dá)及定量
        2.2.11 AIV-HA 單因子血清的獲得
3 結(jié)果
    3.1 AIV-HA 基因的真核表達(dá)質(zhì)粒
        3.1.1 AIV LG1 株 HA 基因的 PCR 擴(kuò)增
        3.1.2 克隆載體的 PCR 鑒定
        3.1.3 序列測(cè)定與分析
        3.1.4 真核表達(dá)質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        3.1.5 真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.2 AIV-HA 基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.1 AIV LG1 株 HA（上、中、下）基因的 PCR 擴(kuò)增
        3.2.2 克隆載體的 PCR 鑒定
        3.2.3 序列測(cè)定與分析
        3.2.4 原核表達(dá)載體的 PCR 鑒定
        3.2.5 序列鑒定
    3.3 真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1-A-HA 在 CEF 上的表達(dá)
    3.4 重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-HA（上、中、下）陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌裂解物的 SDS-PAGE
    3.5 western blot 檢測(cè)
    3.6 兩種單因子血清間接免疫熒光反應(yīng)效價(jià)比較
4 討論
    4.1 HA 基因的提取
    4.2 HA 基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.3 HA 基因真核表達(dá)質(zhì)粒在 CEF 上的表達(dá)
    4.4 HA 蛋白的原核表達(dá)
    4.5 小鼠免疫
    4.6 兩種 HA 單因子血清的 IFA 特異性比較
    4.7 兩種 HA 單因子血清的應(yīng)用
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)介
致謝
碩士期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3806781