近年來，禽流感的暴發(fā)與流行給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全造成了嚴重的危害。2003年12月9日，香港發(fā)生H9N2亞型禽流感疫情，H9N2亞型為低致病性禽流感病毒，但是因為它傳播廣泛，而且同樣可引起人和動物致病，甚至引起疫病的暴發(fā)和流行，其危害不容忽視，做好禽流感的診斷與監(jiān)測顯得尤為重要。更為重要的是禽流感病毒亞型眾多且變異性強，給檢測帶來了很大困難。 禽流感病毒蛋白質(zhì)含有5種多肽，即血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)蛋白、核蛋白和多聚酶。血凝素是流感病毒的主要表面糖蛋白，具有凝集多種動物紅細胞的性質(zhì)，借助HA對細胞受體的作用，使病毒粘附于細胞，在穿膜過程中起關(guān)鍵作用。HA的變異性很強，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因。HA具有誘生中和抗體的能力，產(chǎn)生免疫保護作用，因此血凝素在禽流感的診斷和防治中起重要作用，成為禽流感的研究熱點。 本課題起初是以禽流感HA基因為靶點構(gòu)建真核表達質(zhì)粒。我們首先通過RT-PCR方法擴增了H9N2亞型禽流感病毒的HA基因并克隆插入到真核質(zhì)粒pcDNA3.1-A中，構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-A-HA。將構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CEF，鑒定其在CEF上的表達。同...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 禽流感概述
        1.1.1 禽流感的流行病學特點
        1.1.2 禽流感的主要癥狀和病變
        1.1.3 診斷
        1.1.4 鑒別診斷
        1.1.5 治療
        1.1.6 預防
    1.2 禽流感病毒
        1.2.1 禽流感病毒的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 禽流感病毒的分類與命名
        1.2.3 流感病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白
        1.2.4 流感病毒的復制
        1.2.5 禽流感病毒抗原性的改變
        1.2.6 流感病毒的理化特性
    1.3 HA 基因特點
        1.3.1 HA 基因序列
        1.3.2 HA 編碼的蛋白質(zhì)
        1.3.3 HA 蛋白的生物學功能
    1.4 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 細菌培養(yǎng)基的試劑
        2.1.4 動物和細胞
        2.1.5 細胞培養(yǎng)材料
        2.1.6 轉(zhuǎn)染試劑
        2.1.7 其它試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 主要溶液的配制
        2.2.2 禽流感 HA 基因的釣取
        2.2.3 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 重組真核表達質(zhì)粒在 CEF 上的表達
        2.2.5 HA 基因上、中、下段克隆載體的構(gòu)建
        2.2.6 HA 基因上、中、下段原核表達載體的構(gòu)建
        2.2.7 重組菌的誘導表達
        2.2.8 western blot
        2.2.9 重組蛋白的可溶性分析
        2.2.10 重組原核表達載體 HA 蛋白的大量表達及定量
        2.2.11 AIV-HA 單因子血清的獲得
3 結(jié)果
    3.1 AIV-HA 基因的真核表達質(zhì)粒
        3.1.1 AIV LG1 株 HA 基因的 PCR 擴增
        3.1.2 克隆載體的 PCR 鑒定
        3.1.3 序列測定與分析
        3.1.4 真核表達質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        3.1.5 真核表達質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.2 AIV-HA 基因的原核表達載體的構(gòu)建
        3.2.1 AIV LG1 株 HA（上、中、下）基因的 PCR 擴增
        3.2.2 克隆載體的 PCR 鑒定
        3.2.3 序列測定與分析
        3.2.4 原核表達載體的 PCR 鑒定
        3.2.5 序列鑒定
    3.3 真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1-A-HA 在 CEF 上的表達
    3.4 重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-HA（上、中、下）陽性轉(zhuǎn)化菌裂解物的 SDS-PAGE
    3.5 western blot 檢測
    3.6 兩種單因子血清間接免疫熒光反應效價比較
4 討論
    4.1 HA 基因的提取
    4.2 HA 基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.3 HA 基因真核表達質(zhì)粒在 CEF 上的表達
    4.4 HA 蛋白的原核表達
    4.5 小鼠免疫
    4.6 兩種 HA 單因子血清的 IFA 特異性比較
    4.7 兩種 HA 單因子血清的應用
5 結(jié)論
參考文獻
個人簡介
致謝
碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3806781