剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是呈世界性分布的重要的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲,能夠感染幾乎所有的恒溫動(dòng)物。目前世界范圍內(nèi)弓形蟲的種群結(jié)構(gòu)具備豐富的種系和不同蟲株間的雜交系,其基因型存在高度地域差異。流行于中國地區(qū)的弓形蟲大部分屬于非典型基因型中的Chinese I(TOXODB#9)譜系。Chinese I基因型蟲株與其他蟲株相比較可能具備獨(dú)特的致病性,也許會(huì)引起宿主差異的免疫反應(yīng)。弓形蟲致病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)之一是弓形蟲速殖子與緩殖子的相互轉(zhuǎn)化。二者在形態(tài)上區(qū)別很小,但分子水平存在顯著差異,通過對(duì)期特異基因分子水平上的鑒定,可以確定弓形蟲所處的特定時(shí)期。果蠅的BIN3蛋白(Bicoid-Interacting Protein 3)在果蠅胚胎發(fā)育中起重要作用,弓形蟲中的BIN3蛋白,經(jīng)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)其核心序列與果蠅BIN3蛋白的核心序列具有相似性,因此預(yù)測(cè)弓形蟲BIN3蛋白與蟲體發(fā)育或蟲體極性作用相關(guān)。然而目前關(guān)于弓形蟲BIN3蛋白的研究僅限于在線預(yù)測(cè),對(duì)于Chinese I基因型蟲株BIN3蛋白的研究更是空白。本研究觀察了Chinese I基因型Wh3蟲株BIN3蛋白的定位及其對(duì)Chinese I蟲株免疫保護(hù)作用,并進(jìn)行了Chinese I基因型Wh3蟲株BIN3基因敲除株的初步構(gòu)建,為深入研究弓形蟲Chinese I基因型的防治奠定基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析通過NCBI、TOXODB在線數(shù)據(jù)庫及Expasy、CBS等網(wǎng)站提供的在線軟件初步分析BIN3蛋白,包括基礎(chǔ)理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄后修飾作用等。結(jié)果顯示BIN3蛋白理論上分子量為84.38kD;理論等電點(diǎn)(PI)為7.65;該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu),不含信號(hào)肽。BIN3蛋白定位在細(xì)胞核的概率為78.3%。BIN3蛋白具備3個(gè)N端糖基化位點(diǎn);閾值水平上具備6個(gè)酪氨酸殘基,和多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸殘基;存在酰基化。BIN3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含螺旋、片層、轉(zhuǎn)角和卷曲結(jié)構(gòu)。其中在該段蛋白前段、后端,螺旋結(jié)構(gòu)與片層結(jié)構(gòu)較為豐富,且穿插結(jié)合;卷曲結(jié)構(gòu)主要集中在中部;轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)均勻分布在該段蛋白�？笲IN3蛋白單抗制備設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,在Chinese I基因型Wh3蟲株中獲得BIN3基因克隆,構(gòu)建pET28a-BIN3表達(dá)載體,表達(dá)蛋白并經(jīng)細(xì)胞融合等方法制備相應(yīng)單抗。結(jié)果獲得3株單克隆細(xì)胞株抗體,分別命名為AbM-BIN3:#43,AbM-BIN3:#7和AbM-BIN3:#42。AbM-BIN3:#42接近1:100,000,0,AbM-BIN3:#43和AbM-BIN3:#7均可達(dá)到1:100,000,0單位以上,AbM-BIN3:#43效價(jià)相對(duì)較高。BIN3蛋白在Chinese I基因型Wh3蟲株中的定位蟲體復(fù)蘇后,傳代2-3代,改變體外培養(yǎng)環(huán)境使蟲體處于堿性條件(pH=8.2)下培養(yǎng)。以速殖子期特異基因SAG1,緩殖子期特異基因BAG1,SAG2C作為鑒定基因,判定Wh3株是否被誘導(dǎo)成囊。通過間接免疫熒光技術(shù)對(duì)BIN3蛋白進(jìn)行定位,觀察BIN3蛋白在蟲體中的定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)弓形蟲Chinese I基因型Wh3蟲株在體外堿性誘導(dǎo)條件下可以成囊,經(jīng)過SAG1、BAG1和SAG2C期特異基因的鑒定證實(shí),被誘導(dǎo)蟲株可表達(dá)緩殖子相關(guān)基因。BIN3蛋白在該蟲株中的速殖子和緩殖子時(shí)期均可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)。BIN3蛋白定位位置存在差異,游離狀態(tài)速殖子BIN3蛋白定位于蟲體細(xì)胞質(zhì)內(nèi);假囊狀態(tài)的速殖子BIN3蛋白分泌到蟲體外部,囊膜內(nèi)部;BIN3蛋白分布于包囊的囊壁內(nèi)部。BIN3蛋白在堿性條件誘導(dǎo)的緩殖子中表達(dá)量高于速殖子。BIN3重組蛋白對(duì)Chinese I基因型Wh3株弓形蟲的免疫保護(hù)將BIN3重組蛋白以50μg/只的劑量對(duì)6周齡雌性Balb/c小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射,免疫程序?yàn)?次,免疫結(jié)束后2周,檢測(cè)體液免疫與細(xì)胞因子水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖狀態(tài)。并對(duì)小鼠進(jìn)行攻蟲試驗(yàn),除陰性對(duì)照組外,每只小鼠接種Chinese I基因型Wh3蟲株速殖子1×10~5個(gè),觀察發(fā)病狀態(tài)及記錄死亡時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIN3重組蛋白免疫小鼠后引起小鼠IgG水平上升(P0.05),細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ水平提高(P0.05)。致死劑量(1×10~5個(gè))Wh3蟲株速殖子接種小鼠后,BIN3重組蛋白免疫組比陽性對(duì)照組病程延緩72h。Chinese I基因型Wh3蟲株BIN3基因敲除株構(gòu)建利用CARSPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建BIN3核心序列的敲除蟲株。設(shè)計(jì)BIN3-gRNA引物,構(gòu)建pSAG1-Cas9-suprt質(zhì)粒;構(gòu)建DHFR短同源臂序列,以乙胺嘧啶進(jìn)行藥物篩選,并通過分子水平和蛋白水平鑒定BIN3基因敲除株是否構(gòu)建成功。PCR結(jié)果顯示DHFR片段成功插入BIN3基因,Western blot結(jié)果顯示相應(yīng)蛋白未見表達(dá)。成功構(gòu)建Wh3株BIN3基因敲除蟲株。Vero細(xì)胞中Chinese I基因型BIN3基因敲除株生長速度較野生株緩慢。接種蟲株72h后二者蟲體數(shù)量差異最為明顯(P0.05);120h后BIN3基因敲除株蟲體數(shù)量與野生株相比相差約1.25×10~6。通過對(duì)BIN3基因敲除株噬斑形成能力、入侵能力和逸出能力的測(cè)定發(fā)現(xiàn),BIN3不會(huì)影響速殖子的入侵和逸出,但噬斑形成收到影響,與蟲體發(fā)育有相關(guān)性。Chinese I基因型BIN3敲除株接種小鼠死亡時(shí)間較野生株延遲24h,BIN3基因的敲除對(duì)Chinese I基因型弓形蟲致病力具一定影響。本研究通過誘導(dǎo)弓形蟲Chinese I基因型Wh3非成囊株在體外成囊,觀察發(fā)現(xiàn)BIN3蛋白在速殖子和緩殖子兩個(gè)時(shí)期均可表達(dá)。免疫保護(hù)試驗(yàn)表明BIN3蛋白對(duì)Chinese I基因型Wh3蟲株具有較好免疫保護(hù)作用。通過構(gòu)建BIN3基因敲除株發(fā)現(xiàn)BIN3基因?qū)蜗x發(fā)育有一定影響。從而為深入研究我國弓形蟲病防治提供了依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.72
【部分圖文】：

弓形蟲 BIN3 基因的核心序列與果蠅 Bicoid 基因相關(guān)蛋白 BIN3 核有相似性（見圖 1.2）。同時(shí)，我們考慮到弓形蟲并沒有胚胎，因此預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)的 BIN3 基因，是與弓形蟲的蟲體發(fā)育或者蟲體的極性作用相關(guān)

形蟲陽性檢出率則為 2.90%。其中雄性狐貍感染率為 7.14%，雌性為 8.70%。基因型只有兩種，Chinese I 和 TOXODB#10[119]�？偨Y(jié)中國各個(gè)地區(qū)的弓形蟲基因型流行調(diào)查中，Chinese I（TOXODB本數(shù)的 65.5%。見圖 1.1[95]。

BIN3氨基酸含量
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本文編號(hào)：2835252