鵝卵泡發(fā)育是影響母鵝產蛋量的重要因素,卵泡顆粒細胞的狀態(tài)是決定鵝卵泡發(fā)育的首要條件,在等級前卵泡中顆粒細胞增殖與分化可以保證等級前卵泡的正常發(fā)育成熟并進入等級階段。然而,只有不到1%的等級前卵泡會被選擇成為優(yōu)勢卵泡,絕大部分卵泡會因為卵泡顆粒細胞大量凋亡而發(fā)生閉鎖�？梢娞骄柯雅蓊w粒細胞增殖的調控機制有利于保證卵泡正常發(fā)育,增加優(yōu)勢卵泡數量并提高產蛋量。miRNAs利用種子序列區(qū)與靶基因3'UTR區(qū)部分結合或完全互補配對調控靶基因的轉錄從而影響細胞增殖與卵泡發(fā)育。實驗室前期small RNA測序證實miR-26b-5p在鵝產蛋期與就巢期表達存在顯著差異,預測miR-26b-5p靶基因富集于TGF-β/SMADs信號通路。因此,我們提出miR-26b-5p調控鵝卵泡顆粒細胞增殖的假設。基于此在本試驗中首先探討了 miR-26b-5p對鵝卵泡顆粒細胞增殖的影響,進而深入探究miR-26b-5p介導TGF-β/SMADs信號通路發(fā)揮其生物學功能及轉錄調控機制。本研究旨在揭示miR-26b-5p參與鵝卵泡顆粒細胞增殖的作用機理,同時也為提高母鵝產蛋量提供一定的理論依據。主要結果如下:1、miR-26b-5p調控鵝卵泡顆粒細胞增殖,促進雌激素分泌。為揭示miR-26b-5p對鵝卵泡顆粒細胞增殖的影響,在分離的原代細胞中分別轉染miR-26b-5p mimics和miR-26b-5p inhibitor,利用CCK-8與流式細胞術分別檢測細胞增殖與凋亡。結果顯示,轉染miR-26b-5pmimics后顆粒細胞增殖率顯著上升81.2%(P0.05),而轉染miR-26b-5p inhibitor后細胞增殖被抑制且細胞凋亡顯著上升28%(P0.01)。qRT-PCR結果顯示,轉染miR-26b-5p mimics后抗凋亡基因BCL-2 mRNA表達量顯著上調而促凋亡基因Caspase-3表達量顯著降低,而轉染miR-26b-5p inhibitor后呈現相反趨勢(P0.01)。此外,ELISA檢測結果表明,轉染miR-26b-5p mimics可以顯著增加雌激素分泌水平、降低孕激素水平,而轉染miR-26b-5pinhibitor后同樣表現出相反趨勢(P0.05)。綜上所述,miR-26b-5p可以促進鵝卵泡顆粒細胞增殖,增加顆粒細胞雌激素分泌量,降低孕激素分泌量。2、miR-26b-5p靶向INHBB促進卵泡顆粒細胞增殖。為揭示miR-26b-5p促進卵泡顆粒細胞增殖的作用方式,利用相關網站預測發(fā)現INHBB和SMAD4為miR-26b-5p的潛在靶基因。結合雙熒光素酶基因報告系統,發(fā)現miR-26b-5p可與鵝INHBB 3'UTR結合并極顯著抑制熒光素酶活性(P0.01),而SMAD4熒光素酶活性沒有發(fā)生顯著變化。進一步利用qRT-PCR和Western Blot等方法證實miR-26b-5p可以顯著降低INHBB表達(P0.05)。此外通過ELISA分析發(fā)現miR-26b-5p可以顯著減少鵝卵泡顆粒細胞抑制素分泌量(P0.01)。基于以上結果,發(fā)現miR-26b-5p通過靶向抑制INHBB表達參與調控鵝卵泡顆粒細胞增殖。3、轉錄因子SMAD4調控miR-26b-5p轉錄參與鵝卵泡顆粒細胞增殖。為闡明miR-26b-5p參與鵝卵泡顆粒細胞增殖的分子機制,通過qRT-PCR并利用Promoter Scan網站預測發(fā)現過表達SMAD4可以極顯著增加miR-26b-5p表達量(P0.01),miR-26b-5p基因啟動子區(qū)存在3個SMAD4結合位點(SBE1:-827--815,SBE2:-796--784,SBE3:-298--286)。雙熒光素酶試驗證實轉染含SBE3的片段后熒光活性顯著增強(P0.01),因此SMAD4可作為miR-26b-5p的一種轉錄因子。為深入探究SMAD4介導miR-26b-5p在鵝卵泡顆粒細胞增殖過程中的作用,選擇了SMAD4 所在TGF-β/SMADs信號通路的上游抑制劑,發(fā)現特異性阻斷劑能顯著下調鵝卵泡顆粒細胞SMAD4 mRNA和miR-26b-5p表達量(P0.05),極顯著上調INHBB表達量(P0.01);細胞凋亡率顯著增加62.23%(P0.05),E2分泌水平顯著減少而P4及抑制素B分泌水平顯著增加(P0.05)。以上結果充分說明TGF-β/SMADs信號通路參與調控鵝卵泡顆粒細胞的增殖,通路關鍵因子SMAD4可以作為轉錄因子調控miR-26b-5p轉錄。綜上所述,miR-26b-5p受轉錄因子SMAD4轉錄調控,并通過靶向INHBB介導TGF-β/SMADs信號通路,促進鵝卵泡顆粒細胞的增殖。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S835
【部分圖文】：

妒於◎警義三繼??Ｏｏｇｏｎｉａ?Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ?Ｐｒｉｍａｒｙ?Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ??Ｔｅｒｔｉａｒｙ??Ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ??圖１－１卵泡發(fā)育序列圖［６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＾??卵泡發(fā)生起源于原始卵泡，禽類的原始卵泡發(fā)育于出生前胚胎期或出生后立即形成。??原始卵泡是卵巢上數量最多、體積最小的卵泡，位于卵巢表面，細胞結構簡單，內層是未??分化的初級卵母細胞，外層由單層扁平顆粒細胞所包圍。隨著雌禽發(fā)育至性成熟，原始卵??泡被激活，扁平顆粒細胞生長發(fā)育成立方體時，標志著該原始卵泡成為初級卵泡［３］。初級??卵泡無卵泡膜結構，其卵母細胞與顆粒細胞持續(xù)生長，體積隨之增大。之后初級卵泡生長??發(fā)育速度加快，外層基膜組織分化成為卵泡膜結構，顆粒細胞層增殖分化為２－３層，卵泡??內開始聚集卵黃物質，至此初級卵泡進入次級階段。次級卵泡卵泡膜分化成為卵泡膜外層??與卵泡膜內層

與卵泡膜內層，此時的卵泡顆粒細胞層數減少為單層但單個顆粒體積增大，卵母細胞內出??現空腔并堆積大量營養(yǎng)豐富的卵黃物質，這些卵黃物質使得卵泡體積進一步增大而突出卵??巢基質，由結締組織組成的卵泡柄與卵巢連接，由此卵泡進入成熟階段（圖１－２）?［７４］。禽??類與哺乳動物不同，排卵后并不生成真正的黃體，而是形成由結締組織、上皮樣組織和排??卵后殘留在卵巢內的碎屑組成的囊泡稱為排卵后卵泡（ｐｏｓｔ－ｏｖｕｌａｔｏｒｙｆｏｌｌｉｃｌｅ，ＰＯＦ）。排卵??后卵泡仍依附在卵巢基質上，短時間內還保留一部分類固醇激素分泌功能，在排卵后１０天??內逐漸萎縮并完全喪失其功能后被卵巢吸收［１（）］。??議?ＪＪＩ?ｍ??纖帶?一卜’，平’、??圖１－２母雞成熟卵泡完整結構示意圖［７］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｔｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｈｅｎ?ｍａｔｕｒｅ?ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ１７１??

的協同作用。??卵泡生長發(fā)育接收來自上游垂體分泌性激素的影響，同樣的來源于卵泡的類固醇激素??對下丘腦－垂體存在著反饋機制（圖１－４）。卵泡內分泌的雌激素可以與ＦＳＨ協同作用與卵??泡，刺激卵泡顆粒細胞大量增殖并促進初級卵泡發(fā)育成更高等級的卵泡，于此同時雌激素??被分泌進入血液循環(huán)后作用于下丘腦以及垂體，抑制ＧｎＲＨ、ＦＳＨ和ＬＨ的分泌。禽類卵??泡發(fā)育另外一個重要的類固醇激素－孕激素主要由卵泡顆粒細胞分泌，低濃度的孕激素有利??于卵泡的發(fā)育與排卵，而大劑量的孕激素會作用于垂體，抑制ＦＳＨ與ＬＨ的分泌量，影響??著卵泡發(fā)育與排卵。除此之外，卵泡顆粒細胞還可以分泌激活素（Ａｃｔｉｖｉｎｓ）及抑制素??（Ｉｎｈｉｂｉｎｓ）兩種糖蛋白激素，這兩種激素都屬于ＴＧＦ－Ｐ超家族但功能卻不同，激活素刺激??垂體釋放更多的ＦＳＨ而抑制素卻與之相反，通過負反饋調控垂體釋放ＦＳＨ進而抑制小卵??泡生長發(fā)育。?
【相似文獻】

相關期刊論文 前1條

1 曹文紅;;過表達miR-26b-5p抑制HMGA1參與卵巢癌細胞上皮間質轉化的機制[J];武警醫(yī)學;2019年09期

相關碩士學位論文 前2條

1 路璐;miR-26b-5p調控鵝卵泡顆粒細胞增殖作用機制研究[D];揚州大學;2019年

2 吳唐維;槐耳通過上調肺癌細胞miR-26b-5p的表達抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[D];湖北中醫(yī)藥大學;2014年

本文編號：2835623