鵝卵泡發(fā)育是影響母鵝產(chǎn)蛋量的重要因素,卵泡顆粒細(xì)胞的狀態(tài)是決定鵝卵泡發(fā)育的首要條件,在等級前卵泡中顆粒細(xì)胞增殖與分化可以保證等級前卵泡的正常發(fā)育成熟并進(jìn)入等級階段。然而,只有不到1%的等級前卵泡會被選擇成為優(yōu)勢卵泡,絕大部分卵泡會因為卵泡顆粒細(xì)胞大量凋亡而發(fā)生閉鎖�？梢娞骄柯雅蓊w粒細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制有利于保證卵泡正常發(fā)育,增加優(yōu)勢卵泡數(shù)量并提高產(chǎn)蛋量。miRNAs利用種子序列區(qū)與靶基因3'UTR區(qū)部分結(jié)合或完全互補(bǔ)配對調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄從而影響細(xì)胞增殖與卵泡發(fā)育。實驗室前期small RNA測序證實miR-26b-5p在鵝產(chǎn)蛋期與就巢期表達(dá)存在顯著差異,預(yù)測miR-26b-5p靶基因富集于TGF-β/SMADs信號通路。因此,我們提出miR-26b-5p調(diào)控鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖的假設(shè)。基于此在本試驗中首先探討了 miR-26b-5p對鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響,進(jìn)而深入探究miR-26b-5p介導(dǎo)TGF-β/SMADs信號通路發(fā)揮其生物學(xué)功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本研究旨在揭示miR-26b-5p參與鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖的作用機(jī)理,同時也為提高母鵝產(chǎn)蛋量提供一定的理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:1、miR-26b-5p調(diào)控鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖,促進(jìn)雌激素分泌。為揭示miR-26b-5p對鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響,在分離的原代細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-26b-5p mimics和miR-26b-5p inhibitor,利用CCK-8與流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞增殖與凋亡。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-26b-5pmimics后顆粒細(xì)胞增殖率顯著上升81.2%(P0.05),而轉(zhuǎn)染miR-26b-5p inhibitor后細(xì)胞增殖被抑制且細(xì)胞凋亡顯著上升28%(P0.01)。qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-26b-5p mimics后抗凋亡基因BCL-2 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)而促凋亡基因Caspase-3表達(dá)量顯著降低,而轉(zhuǎn)染miR-26b-5p inhibitor后呈現(xiàn)相反趨勢(P0.01)。此外,ELISA檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-26b-5p mimics可以顯著增加雌激素分泌水平、降低孕激素水平,而轉(zhuǎn)染miR-26b-5pinhibitor后同樣表現(xiàn)出相反趨勢(P0.05)。綜上所述,miR-26b-5p可以促進(jìn)鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖,增加顆粒細(xì)胞雌激素分泌量,降低孕激素分泌量。2、miR-26b-5p靶向INHBB促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖。為揭示miR-26b-5p促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖的作用方式,利用相關(guān)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)INHBB和SMAD4為miR-26b-5p的潛在靶基因。結(jié)合雙熒光素酶基因報告系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)miR-26b-5p可與鵝INHBB 3'UTR結(jié)合并極顯著抑制熒光素酶活性(P0.01),而SMAD4熒光素酶活性沒有發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步利用qRT-PCR和Western Blot等方法證實miR-26b-5p可以顯著降低INHBB表達(dá)(P0.05)。此外通過ELISA分析發(fā)現(xiàn)miR-26b-5p可以顯著減少鵝卵泡顆粒細(xì)胞抑制素分泌量(P0.01)。基于以上結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-26b-5p通過靶向抑制INHBB表達(dá)參與調(diào)控鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖。3、轉(zhuǎn)錄因子SMAD4調(diào)控miR-26b-5p轉(zhuǎn)錄參與鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖。為闡明miR-26b-5p參與鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,通過qRT-PCR并利用Promoter Scan網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SMAD4可以極顯著增加miR-26b-5p表達(dá)量(P0.01),miR-26b-5p基因啟動子區(qū)存在3個SMAD4結(jié)合位點(SBE1:-827--815,SBE2:-796--784,SBE3:-298--286)。雙熒光素酶試驗證實轉(zhuǎn)染含SBE3的片段后熒光活性顯著增強(qiáng)(P0.01),因此SMAD4可作為miR-26b-5p的一種轉(zhuǎn)錄因子。為深入探究SMAD4介導(dǎo)miR-26b-5p在鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖過程中的作用,選擇了SMAD4 所在TGF-β/SMADs信號通路的上游抑制劑,發(fā)現(xiàn)特異性阻斷劑能顯著下調(diào)鵝卵泡顆粒細(xì)胞SMAD4 mRNA和miR-26b-5p表達(dá)量(P0.05),極顯著上調(diào)INHBB表達(dá)量(P0.01);細(xì)胞凋亡率顯著增加62.23%(P0.05),E2分泌水平顯著減少而P4及抑制素B分泌水平顯著增加(P0.05)。以上結(jié)果充分說明TGF-β/SMADs信號通路參與調(diào)控鵝卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,通路關(guān)鍵因子SMAD4可以作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控miR-26b-5p轉(zhuǎn)錄。綜上所述,miR-26b-5p受轉(zhuǎn)錄因子SMAD4轉(zhuǎn)錄調(diào)控,并通過靶向INHBB介導(dǎo)TGF-β/SMADs信號通路,促進(jìn)鵝卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S835
【部分圖文】：

妒於◎警義三繼??Ｏｏｇｏｎｉａ?Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ?Ｐｒｉｍａｒｙ?Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ??Ｔｅｒｔｉａｒｙ??Ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ??圖１－１卵泡發(fā)育序列圖［６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＾??卵泡發(fā)生起源于原始卵泡，禽類的原始卵泡發(fā)育于出生前胚胎期或出生后立即形成。??原始卵泡是卵巢上數(shù)量最多、體積最小的卵泡，位于卵巢表面，細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)層是未??分化的初級卵母細(xì)胞，外層由單層扁平顆粒細(xì)胞所包圍。隨著雌禽發(fā)育至性成熟，原始卵??泡被激活，扁平顆粒細(xì)胞生長發(fā)育成立方體時，標(biāo)志著該原始卵泡成為初級卵泡［３］。初級??卵泡無卵泡膜結(jié)構(gòu)，其卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞持續(xù)生長，體積隨之增大。之后初級卵泡生長??發(fā)育速度加快，外層基膜組織分化成為卵泡膜結(jié)構(gòu)，顆粒細(xì)胞層增殖分化為２－３層，卵泡??內(nèi)開始聚集卵黃物質(zhì)，至此初級卵泡進(jìn)入次級階段。次級卵泡卵泡膜分化成為卵泡膜外層??與卵泡膜內(nèi)層

與卵泡膜內(nèi)層，此時的卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)減少為單層但單個顆粒體積增大，卵母細(xì)胞內(nèi)出??現(xiàn)空腔并堆積大量營養(yǎng)豐富的卵黃物質(zhì)，這些卵黃物質(zhì)使得卵泡體積進(jìn)一步增大而突出卵??巢基質(zhì)，由結(jié)締組織組成的卵泡柄與卵巢連接，由此卵泡進(jìn)入成熟階段（圖１－２）?［７４］。禽??類與哺乳動物不同，排卵后并不生成真正的黃體，而是形成由結(jié)締組織、上皮樣組織和排??卵后殘留在卵巢內(nèi)的碎屑組成的囊泡稱為排卵后卵泡（ｐｏｓｔ－ｏｖｕｌａｔｏｒｙｆｏｌｌｉｃｌｅ，ＰＯＦ）。排卵??后卵泡仍依附在卵巢基質(zhì)上，短時間內(nèi)還保留一部分類固醇激素分泌功能，在排卵后１０天??內(nèi)逐漸萎縮并完全喪失其功能后被卵巢吸收［１（）］。??議?ＪＪＩ?ｍ??纖帶?一卜’，平’、??圖１－２母雞成熟卵泡完整結(jié)構(gòu)示意圖［７］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｔｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｈｅｎ?ｍａｔｕｒｅ?ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ１７１??

的協(xié)同作用。??卵泡生長發(fā)育接收來自上游垂體分泌性激素的影響，同樣的來源于卵泡的類固醇激素??對下丘腦－垂體存在著反饋機(jī)制（圖１－４）。卵泡內(nèi)分泌的雌激素可以與ＦＳＨ協(xié)同作用與卵??泡，刺激卵泡顆粒細(xì)胞大量增殖并促進(jìn)初級卵泡發(fā)育成更高等級的卵泡，于此同時雌激素??被分泌進(jìn)入血液循環(huán)后作用于下丘腦以及垂體，抑制ＧｎＲＨ、ＦＳＨ和ＬＨ的分泌。禽類卵??泡發(fā)育另外一個重要的類固醇激素－孕激素主要由卵泡顆粒細(xì)胞分泌，低濃度的孕激素有利??于卵泡的發(fā)育與排卵，而大劑量的孕激素會作用于垂體，抑制ＦＳＨ與ＬＨ的分泌量，影響??著卵泡發(fā)育與排卵。除此之外，卵泡顆粒細(xì)胞還可以分泌激活素（Ａｃｔｉｖｉｎｓ）及抑制素??（Ｉｎｈｉｂｉｎｓ）兩種糖蛋白激素，這兩種激素都屬于ＴＧＦ－Ｐ超家族但功能卻不同，激活素刺激??垂體釋放更多的ＦＳＨ而抑制素卻與之相反，通過負(fù)反饋調(diào)控垂體釋放ＦＳＨ進(jìn)而抑制小卵??泡生長發(fā)育。?
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1 路璐;miR-26b-5p調(diào)控鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖作用機(jī)制研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

2 吳唐維;槐耳通過上調(diào)肺癌細(xì)胞miR-26b-5p的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2014年

本文編號：2835623