目前抗生素濫用對人和動物健康造成的損害以及對環(huán)境的破壞日益突出,這種情況迫使研究人員不斷尋找可以替代抗生素的物質(zhì)。防御素在替代抗生素方面擁有無限潛能,是一類具有廣譜抗微生物活性的小分子天然免疫抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)。β-防御素是防御素家族中分布最廣的一類防御素,廣泛分布于哺乳動物、禽類和魚類體內(nèi),而綿羊β-防御素-1(sheep beta defensin-1,SBD-1)是綿羊胃腸道內(nèi)分布最為廣泛的防御素,尤其在綿羊瘤胃中高度表達(dá)。本試驗在mRNA和蛋白水平研究釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物對綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(ovineruminal epithelia cells,ORECs)SBD-1 表達(dá)的影響。試驗首先對 ORECs進(jìn)行體外培養(yǎng);用超聲破碎法將培養(yǎng)的釀酒酵母菌破碎以提取細(xì)胞壁,再運用復(fù)合酶法提取細(xì)胞壁蛋白粗提物;然后以濃度為0、12.5、25、50和100μg/mL的釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物刺激ORECs 2、4、8和12 h;最后通過實時熒光定量PCR技術(shù)(quantitative real-time PCR,qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測不同濃度的釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物誘導(dǎo)ORECs不同時間后SBD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明:本試驗在體外成功的培養(yǎng)了 ORECs,且當(dāng)原代細(xì)胞生長到第12 d時基本將細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底鋪滿。運用復(fù)合酶法所提取的釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測符合顯色范圍。且不論在mRNA還是蛋白水平上,釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物都可以誘導(dǎo)ORECs SBD-1的表達(dá),且當(dāng)釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物濃度為100 μg/mL誘導(dǎo)ORECs 12 h時,SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最大。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S816
【部分圖文】：

本試驗是檢測釀酒酵母菌細(xì)胞壁蛋白粗提物對ＯＲＥＣｓ分泌的ＳＢＤ－１蛋白的影??響。收集之前刺激不同時間的上清液，按照武漢新啟迪生物科技有限公司綿羊防御素??Ｐ１ＥＬＩＳＡ試劑盒說明書步驟進(jìn)行本試驗，具體試驗步驟如圖２。??Ｉ??

當(dāng)胰蛋白酶對瘤胃組織的消化時間改變時，消化液中的細(xì)胞形態(tài)也隨之發(fā)生變化。??當(dāng)顯微鏡視野內(nèi)不規(guī)則片狀細(xì)胞減少，圓而亮的細(xì)胞逐漸增多時，開始收集。本試驗??從第３次開始收集（圖３），收集到第７次后停止消化，期間每次消化后的細(xì)胞都用??同等體積的含有２０％血清的培養(yǎng)基終止消化，最后將細(xì)胞離心培養(yǎng)。??＇?＂?：?／．＇廣?ｕ．：．?．?■：；，?．?■．?．乂．：，：：：：．．，；??：歉：：?Ｖｉ?？雙／：：：??？?．??＇＇?＾?Ｘ＆－＇??＇?八．ｙ?＂■??Ａ?＇?１〇Ｑ?－??圖３第３次消化后的消化液情況??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ?ｊｕｉｃｅ?ａｆｔｅｒ?ｔｈｅ?ｔｈｉｒｄ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．?２?ＯＲＥＧｓ原代以及傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果??培養(yǎng)到第５?ｄ的細(xì)胞在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有單個或呈小團(tuán)狀的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形??態(tài)正常（圖４Ａ）；培養(yǎng)９ｄ后的細(xì)胞連成大片集落生長，但集落之間仍有較大空隙（圖??４Ｂ）；培養(yǎng)Ｉ２ｄ后可見細(xì)胞生長形態(tài)正常，細(xì)胞島嶼之間基本沒有空隙，完全連接，??此時即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖４Ｃ）。然后使用胰蛋白酶消化液對原代貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化??再培養(yǎng)

ＮＡ濃度測定與分析??提取的ＯＲＥＣｓＲＮＡ用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值都度在２００?ｎｇ／ｐＬ左右，說明本次試驗提取的ＲＮＡ純度和濃度都符合下。??ＣＲ結(jié)果（擴(kuò)增曲線和熔解曲線）??ＣＲ擴(kuò)增曲線如圖６所示，從圖中可以看出本試驗擴(kuò)增效果良好，曲線
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2835251