本文關(guān)鍵詞：小鼠卵母細胞中周期蛋白B1的mRNA存儲與釋放的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：處理小體(P小體)是一種存在于真核細胞質(zhì)的蛋白顆粒,它由多種酶組成并參與mRNA調(diào)控。卵母細胞的成熟是一個持續(xù)時間長且復(fù)雜的過程。小鼠卵母細胞的成熟過程存在轉(zhuǎn)錄靜默的現(xiàn)象,即小鼠卵母細胞從GV期到二細胞期小鼠卵母細胞不進行任何轉(zhuǎn)錄活動。然而,小鼠卵母細胞成熟過程需要大量蛋白的參與。不同基因序列,在正確時間的表達是必不可少的。成熟過程中新合成的蛋白只來源于母源mRNA為模板翻譯形成的產(chǎn)物。因此,小鼠卵母細胞對母源mRNA的精確調(diào)控在小鼠卵母細胞成熟進程中顯得尤為重要。淋巴轉(zhuǎn)移蛋白51(MLN51)是一種通過與外顯子連接復(fù)合體(EJC)偶聯(lián)而參與mRNA調(diào)控的蛋白。最新的研究報道稱MLN51定位于P小體中,且過量表達MLN51會導致P小體分解從而導致其包涵的mRNA釋放到細胞質(zhì)中。這里我們對P小體和應(yīng)激顆粒的主要類型結(jié)構(gòu)進行綜述,并著重討論小鼠卵母細胞內(nèi)存在的一種P小體類似顆粒在小鼠卵母細胞成熟過程中調(diào)控mRNA的作用,提出了P小體類似顆粒在小鼠卵母細胞成熟調(diào)控中發(fā)揮作用的可能機制。周期蛋白B1(CyclinB1)是參與有絲分裂和減數(shù)分裂的一種調(diào)節(jié)蛋白。。在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中期CyclinB1蛋白大量表達,其與MPF的活性亞基CDK1結(jié)合,從而促進卵母細胞進入減數(shù)分裂的后期,之后CyclinB1被降解,在減數(shù)分裂的后期,其含量幾乎為零。由于CyclinB1在卵母細胞成熟過程中存在兩個峰值,故對其mRNA探究有著較為重要的意義。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了不同功能的CyclinB1變體,這些變體的mRNA能否通過mRNA監(jiān)控機制從而重新進入P小體有待進一步正式,對這些變體的mRNA在小鼠卵母細胞內(nèi)代謝調(diào)控的研究有一定的意義。本試驗以小鼠的P19細胞為材料,利用熒光原位雜交的方法,探求了CyclinB1的mRNA在P19細胞中的地位。然后以小鼠卵母細胞為材料,對小鼠MLN51、CyclinB1全長分子及其變體在小鼠卵母細胞成熟中所起的作用進行了探討。首先,我們成功克隆小鼠全長型的MLN51基因以及CyclinB1基因并構(gòu)建了真核表達載體pVenus-MLN51以及pVenus-CyclinB1,并在pVenus-CyclinB1的基礎(chǔ)上構(gòu)建了CyclinB1變體的真核表達載體pVenus-D90-CyclinB1、pVenus-Y167a-CyclinB1和pVenus-D90-Y167a-CyclinB1。所有真核表達載體轉(zhuǎn)染Hela細胞均能夠正常表達。本研究利用武漢博士德生物公司的CyclinB1原位雜交檢測試劑盒,成功對小鼠P19細胞中的CycinB1的mRNA進行染色,并用熒光顯微鏡觀察到CyclinB1的mRNA在細胞胞漿著色紅色。將小鼠pVenus-MLN51、pVenus-CyclinB1以及CyclinB1變體的真核表達載體進行體外轉(zhuǎn)錄,將得到的cRNA通過顯微注射的方法注射入培養(yǎng)了1小時的牛卵母細胞內(nèi),通過熒光顯微鏡觀察到其定位,并且統(tǒng)計卵母細胞生發(fā)泡破裂率和第一極體排出率。
【關(guān)鍵詞】：周期蛋白B1 P小體 母源mRNA 小鼠 卵母細胞成熟
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S814
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文獻綜述12-27
• 第一章 P小體及其結(jié)構(gòu)與功能12-18
• 1.1 P小體的結(jié)構(gòu)14
• 1.2 P小體的主要功能14-15
• 1.3 P小體與應(yīng)激顆粒的關(guān)聯(lián)15-16
• 1.4 MLN51促進小體分解16-18
• 第二章 卵母細胞的成熟過程及卵母細胞中mRNA存儲顆粒18-27
• 2.1 P小體類似顆粒在卵母細胞中對特定的mRNA調(diào)控20-23
• 2.2 小鼠卵母細胞mRNA顆粒的猜想23-24
• 2.3 小鼠卵母細胞，對于母源mRNA的再利用存在兩種形式24-27
• 試驗研究27-46
• 第三章 小鼠 MLN51、Cyclin B1 基因的克隆和真核表達載體的構(gòu)建以及 FISH27-41
• 3.1 材料和方法27-32
• 3.1.1 實驗試劑27-28
• 3.1.2 實驗材料28
• 3.1.3 MLN51，CyclinB1及其變體的基因克隆和真核表達載體的構(gòu)建28-31
• 3.1.4 小鼠P19細胞CyclinB1的mRNA熒光原位雜交31-32
• 3.2 結(jié)果32-38
• 3.2.1 小鼠肝臟組織中MLN51 CDS全長克隆及雙酶切鑒定32-33
• 3.2.2 小鼠卵巢組織中CyclinB1 CDS和CyclinB1變體的克隆以及雙酶切鑒定33-36
• 3.2.3 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒pVenus-MLN51在Hela細胞中的表達、定位36-38
• 3.2.4 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒pVenus-CyclinB1及其變體質(zhì)粒在Hela細胞中的表達、定位38
• 3.2.5 小鼠P19細胞中CyclinB1的mRNA的定位38
• 3.3 討論38-39
• 3.4 小結(jié)39-41
• 第四章 MLN51、CyclinB1及其變體在小鼠卵母細胞中的 作用的初步研究41-46
• 4.1 材料和方法41-44
• 4.1.1 主要試劑41
• 4.1.2 試驗材料41
• 4.1.3 在成熟的小鼠卵母細胞中表達MLN51和CyclinB1基因41-44
• 4.2 結(jié)果44-45
• 4.2.1 外源MLN51蛋白在小鼠卵母細胞中的定位44
• 4.2.2 CyclinB1及其變體在成熟小鼠卵母細胞中的表達定位44
• 4.2.3 在顯微注射MLN51和CyclinB1 cRNA后小鼠卵母細胞體外成熟率的變化44-45
• 4.3 討論45
• 4.4 小結(jié)45-46
• 結(jié)論46-47
• 本研究的創(chuàng)新點與進一步研究的課題47-48
• 參考文獻48-55
• 致謝55-56
• 作者簡介56

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