本文關(guān)鍵詞：中國(guó)荷斯坦牛INCENP基因的多態(tài)性及對(duì)精液品質(zhì)影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中國(guó)荷斯坦公牛的精液品質(zhì)顯著影響母牛的繁殖效率。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,候選基因法在遺傳育種中得到了廣泛應(yīng)用。結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究,本研究擬選INCENP基因?yàn)楹蜻x基因,鑒定與種公牛精液品質(zhì)相關(guān)的功能性SNPs,并分析功能性SNPs的分子調(diào)控機(jī)理。1.中國(guó)荷斯坦牛INCENP基因啟動(dòng)子活性分析根據(jù)生物信息軟件預(yù)測(cè),在INCENP基因5'側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)。通過(guò)構(gòu)建缺失片段p GL3重組質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞,確定了5'側(cè)翼區(qū)核心啟動(dòng)子位置位于g.-532~g.-145。同時(shí),通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn),在啟動(dòng)子區(qū)鑒定出兩個(gè)SNPs:g.-556GT和g.-692 CT。運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明g.-556 GT與鮮精活力顯著相關(guān)。另外,利用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法對(duì)5'端側(cè)翼區(qū)所發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SNPs進(jìn)行了功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)p GL3-TG載體的相對(duì)熒光素酶活性顯著高于野生型的p GL3-CG的活性。推測(cè),g.-556 GT和g.-692 CT為啟動(dòng)子區(qū)功能性突變位點(diǎn),可通過(guò)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性來(lái)調(diào)控INCENP基因表達(dá),進(jìn)而影響精液品質(zhì)性狀。2.中國(guó)荷斯坦牛INCENP基因可變剪切體的鑒定及相關(guān)SNP功能驗(yàn)證通過(guò)RT-PCR、克隆測(cè)序在中國(guó)荷斯坦牛睪丸組織中檢測(cè)到1種新的INCENP可變剪接體,命名為INCENP-TV。利用q RT-PCR檢測(cè)INCENP基因在心、肝、脾、肺、腎、睪丸中的表達(dá)水平。結(jié)果表明INCENP基因的表達(dá)沒(méi)有組織特異性,但在脾和睪丸中的表達(dá)量顯著高于其他組織。INCENP參考轉(zhuǎn)錄本(INCENP-reference)和新發(fā)現(xiàn)的可變剪切體(INCENP-TV),在成年公牛和新生公牛中都有表達(dá),但在成年公牛中的表達(dá)量顯著高于新生小公牛。另外,在成年公牛的睪丸中,INCENP-TV的表達(dá)量顯著高于INCENP-reference,然而在新生公牛中差異不顯著,推測(cè)INCENP基因可能與精子發(fā)生密切相關(guān)。為了探究可變剪切的產(chǎn)生機(jī)理,通過(guò)測(cè)序在第十一內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)(g.19970 AG)。利用ESEfinder 3.0軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),由于g.19970位點(diǎn)G等位基因的引入增加了SRSF1、SRSF1(Ig M-BRCA1)和SRSF5三種剪切蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、RT-PCR及克隆測(cè)序技術(shù),發(fā)現(xiàn)g.19970位點(diǎn)為A等位基因時(shí)存在兩種轉(zhuǎn)錄本,INCENP-reference和INCENP-TV;但是當(dāng)A突變?yōu)镚后,只檢測(cè)到了INCENP-TV,所以推測(cè)此SNP可能增強(qiáng)了剪切因子的作用。另外,運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明g.19970 AG與鮮精活力顯著相關(guān)。3.中國(guó)荷斯坦牛bta-miR-378對(duì)INCNEP基因3'UTR靶位點(diǎn)的調(diào)控分析通過(guò)測(cè)序,在INCENP基因3'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn):g.34078 TG。運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明g.34078 TG與鮮精活力顯著相關(guān)。成熟miRNA可影響靶基因m RNA的表達(dá)水平,通過(guò)RNA22和RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),bta-miR-378可以結(jié)合到INCENP基因3'非翻譯區(qū),且g.34078 TG突變前后結(jié)合3'非翻譯區(qū)能力有變化。分別將野生型和突變型的3'UTR連接到p MIR報(bào)告載體中,并且和btamiR-378載體共轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn),bta-miR-378可與INCENP基因的3'UTR區(qū)結(jié)合,并且發(fā)現(xiàn)突變型報(bào)告基因的表達(dá)量低于野生型,表明g.34078 TG-GG與miR-378的結(jié)合能力比g.34078 TG-TT強(qiáng)。由此推測(cè),btamiR-378可與INCENP的3'側(cè)翼區(qū)結(jié)合,從而降低INCENP基因的表達(dá)水平。4.中國(guó)荷斯坦牛INCNEP基因單倍型組合與精液品質(zhì)的相關(guān)性分析根據(jù)鑒定出的g.-556 GT、g.-692 CT、g.19970 AG和g.34078 TG構(gòu)建單倍型組合,在實(shí)驗(yàn)群體中發(fā)現(xiàn)7種單倍型和13種單倍型組合。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,H1H12和H2H2個(gè)體的射精量顯著高于H2H10和H11H11;H11H11和H2H10鮮精活力顯著高于H2H2。由此推測(cè)g.-692 CT、g.-556 GT、g.19970 AG和g.34078TG為功能性SNPs,在調(diào)控精液性狀方面具有重要的作用。5.中國(guó)荷斯坦牛INCENP基因不同單倍型組合個(gè)體m RNA表達(dá)水平通過(guò)q RT-PCR評(píng)估INCENP基因不同單倍型組合個(gè)體的m RNA表達(dá)水平。結(jié)果表明,單倍型組合個(gè)體H11H11(TTTTGGTT)和H1H12(CTGTAGTG)的m RNA表達(dá)量顯著高于H2H10(CTGTAAGG),H2H2(CCGGAAGG)和H9H12(TTTTAGTG),推測(cè)SNPs,g.19970 AG,g.34078 TG,g.-692 CT和g.-556 GT,為INCENP基因的功能性SNPs,可調(diào)控INCENP基因的表達(dá)水平。
【關(guān)鍵詞】：INCENP 可變剪切 啟動(dòng)子 3’UTR bta-miR-378 單倍型組合 精液品質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 前言13-22
• 1.1 中國(guó)荷斯坦種公牛精液品質(zhì)的研究進(jìn)展13-18
• 1.1.1 評(píng)價(jià)種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的相關(guān)指標(biāo)13
• 1.1.2 分子育種在種公牛選育中的重要性13-18
• 1.1.2.1 單核苷酸多態(tài)性14
• 1.1.2.2 啟動(dòng)子14-15
• 1.1.2.3 基因選擇性剪切15-17
• 1.1.2.4 MicroRNAs17-18
• 1.2 INCENP基因研究進(jìn)展18-21
• 1.2.1 染色體乘客復(fù)合體18-20
• 1.2.2 INCENP基因的結(jié)構(gòu)與功能20-21
• 1.2.3 INCENP基因研究概況及意義21
• 1.3 本論文的研究目的及意義21-22
• 2 材料與方法22-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)樣品采集22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-37
• 2.2.1 INCENP基因啟動(dòng)子活性分析24-29
• 2.2.1.1 基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)24
• 2.2.1.2 公牛精子DNA提取24
• 2.2.1.3 INCENP基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs鑒定及PCR-RFLP基因分型24-26
• 2.2.1.4 INCENP基因啟動(dòng)子區(qū)載體構(gòu)建及鑒定26-27
• 2.2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)27-28
• 2.2.1.6 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染28
• 2.2.1.7 熒光素酶活性檢測(cè)28
• 2.2.1.7 INCENP基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析28-29
• 2.2.2 INCENP基因可變剪切體鑒定與表達(dá)分析29-33
• 2.2.2.1 各組織總RNA的提取和cDNA的合成29
• 2.2.2.2 目的片段膠回收29-30
• 2.2.3.3 TA克隆30
• 2.2.2.4 熒光定量PCR30
• 2.2.2.5 INCENP基因可變剪切體相關(guān)SNPs的鑒定、PCR-RFLP基因分型及功能預(yù)測(cè)30-31
• 2.2.2.6 pSPL3外顯子捕獲載體質(zhì)粒構(gòu)建31-32
• 2.2.2.7 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染32-33
• 2.2.2.9 INCENP基因編碼區(qū)SNP與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析33
• 2.2.3 bta-miR-378對(duì)INCNEP基因 3’TR靶位點(diǎn)的調(diào)控分析33-35
• 2.2.3.1 基因 3'翼區(qū)SNPs鑒定及PCR-RFLP33
• 2.2.3.2 靶向 3'TR的mi RNA預(yù)測(cè)及表達(dá)分析33-34
• 2.2.3.3 INCENP基因 3'UTR質(zhì)粒構(gòu)建34
• 2.2.3.4 bta-miR-378質(zhì)粒構(gòu)建34-35
• 2.2.3.5 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及熒光檢測(cè)35
• 2.2.3.6 INCENP基因 3'UTR區(qū)SNP與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析35
• 2.2.4 INCNEP基因單倍型組合與精液品質(zhì)的相關(guān)性分析35
• 2.2.4.1 運(yùn)用SAS軟件分析不同INCENP基因單倍型組合與精液品質(zhì)的相關(guān)35
• 2.2.5 INCENP基因mRNA表達(dá)水平35-37
• 2.2.5.1 凍精RNA提取35-36
• 2.2.5.2 qRT-PCR分析不同INCENP基因單倍型組合個(gè)體mRNA表達(dá)36-37
• 3 結(jié)果與分析37-53
• 3.1 INCENP基因啟動(dòng)子活性分析37-41
• 3.1.1 啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)37
• 3.1.2 凍精DNA提取37-38
• 3.1.3 INCENP基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs鑒定、功能預(yù)測(cè)及PCR-RFLP分型38-39
• 3.1.4 熒光檢測(cè)及啟動(dòng)子活性分析39-40
• 3.1.5 INCENP基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs與公牛精液性狀的相關(guān)性分析40-41
• 3.2 INCENP基因可變剪切體鑒定與表達(dá)分析41-48
• 3.2.1 各組織RNA質(zhì)量和純度檢測(cè)41-42
• 3.2.2 INCENP基因可變剪切體鑒定42-43
• 3.2.3 轉(zhuǎn)錄本相對(duì)定量43-44
• 3.2.4 SNP的鑒定、PCR-RFLP及功能預(yù)測(cè)44-45
• 3.2.5 pSPL3外顯子捕獲載體質(zhì)粒構(gòu)建45-46
• 3.2.6 通過(guò)微基因剪切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SNP對(duì)可變剪切體產(chǎn)生的影響46-47
• 3.2.7 INCENP基因編碼區(qū)SNPs與公牛精液性狀的相關(guān)性分析47-48
• 3.3 bta-miR-378對(duì)INCNEP基因 3'UTR靶位點(diǎn)的調(diào)控分析48-51
• 3.3.1 3'UTR區(qū)SNP的鑒定及PCR-RFLP48-49
• 3.3.2 靶向 3'UTR的mi RNA預(yù)測(cè)及表達(dá)分析49-50
• 3.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證SNP功能50
• 3.3.4 INCENP基因 3'UTR區(qū)SNPs與公牛精液性狀的相關(guān)性分析50-51
• 3.4 INCNEP基因單倍型組合與精液品質(zhì)的相關(guān)性分析51-52
• 3.4.1 不同單倍型組合與精液品質(zhì)相關(guān)性分析51-52
• 3.5 INCENP基因不同單倍型組合個(gè)體mRNA表達(dá)水平52-53
• 4 討論53-56
• 5 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況67

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9 付小波;中國(guó)荷斯坦牛和黃改奶牛CSN1S2基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

10 郭江汀;中國(guó)荷斯坦牛CCL3基因遺傳多態(tài)性與其耐熱性的關(guān)聯(lián)分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：中國(guó)荷斯坦牛INCENP基因的多態(tài)性及對(duì)精液品質(zhì)影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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