發(fā)布時間：2017-03-25 02:00

  本文關鍵詞：屎腸球菌噬菌體IME-EFm5的分離鑒定及其裂解酶關鍵作用位點的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：屎腸球菌(Enterococcus faecium)是一種革蘭氏陽性條件致病菌。當機體免疫力低下時,可能會引起多種局部或全身的感染性疾病。烈性噬菌體(Lytic bacteriophage)是一種可以特異性感染和殺死宿主菌的病毒。噬菌體裂解酶(Lysin)是感染后期由噬菌體基因組編碼的一種可以水解細胞壁的蛋白酶。噬菌體及其裂解酶可以特異、高效地裂解細菌。由于耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)和新型抗菌藥物的缺乏,噬菌體及其裂解酶成為了一個研究熱點。本實驗對屎腸球菌噬菌體及其裂解酶進行了系統(tǒng)研究。首先,從醫(yī)院的污水中分離得到了23株屎腸球菌,藥敏實驗顯示,其中9株為萬古霉素抗性菌株。然后,以一株萬古霉素抗性屎腸球菌4P-SA為受體菌株,分離得到了一株新型屎腸球菌噬菌體,命名為IME-EFm5。對其生物學特性進行研究,該噬菌體屬于有尾病毒目、長尾病毒科,頭部呈二十面體,直徑約為50nm,尾部較長,約為165nm;最佳感染復數(shù)為0.01,噬菌體滴度可達到109 PFU/m L;一步生長曲線顯示,其潛伏期約為30min,裂解周期約為70min;IME-EFm5對乙醚和氯仿不敏感;在溫度為40℃、50℃和p H值為6.0~9.0的環(huán)境中活性基本穩(wěn)定;點滴法和雙層平板法都顯示,IME-EFm5僅對其宿主菌4P-SA起裂解作用,因而,該噬菌體具有高度的宿主保守性;由SDS-PAGE結果可知,結構蛋白種類多,最主要的結構蛋白大小約為36k Da。對噬菌體IME-EFm5的全基因組進行測序與分析,可知該噬菌體的遺傳物質(zhì)為雙鏈DNA,大小為42,265bp,含有70個開放閱讀框(ORFs),G+C%為35.51 mol%。通過同源蛋白數(shù)據(jù)比對分析,該噬菌體的全基因組序列僅與屎腸球菌噬菌體IME-EFm1的基因組具有較高的相似性。對該噬菌體裂解酶Lys EFm5深入研究表明:Lys EFm5表現(xiàn)出了高效的殺菌活性,可以裂解19株屎腸球菌,包括7株萬古霉素抗性菌株,裂解譜遠遠高于噬菌體本身。因而,Lys EFm5具有治療耐藥性屎腸球菌感染的潛力。同源蛋白的比對分析可知,Lys EFm5的N端可能是amidase家族中的一員。盡管序列差異較大,但是Lys EFm5 amidase片段與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Lys GH15的amidase-2片段的3D結構具有很高的同源性。突變蛋白構建后,通過圓二色譜法對Lys EFm5和突變蛋白的二級結構進行檢測,結果表明,單個位點氨基酸突變?yōu)楸彼岵挥绊懙鞍椎亩壗Y構。酶譜實驗和ICP-AES檢測結果表明:突變蛋白的活性全部喪失;H27,H132和C140三個氨基酸為Zn2+結合位點;E90和T138為催化活性位點。EDTA處理后,Lys EFm5的活性不受影響,ICP-AES只能檢測到微量的Zn2+存在。因而,Lys EFm5不同于其它amidase家族成員,為Zn2+非依賴性水解酶,揭示了一個獨特的催化機制。本論文通過對Lys EFm5特性的研究,有力地推進了人們對噬菌體裂解酶amidase片段分子作用機制的認識。
【關鍵詞】：屎腸球菌 噬菌體裂解酶 酰胺酶 Zn2+非依賴性
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻綜述14-24
• 第一章 噬菌體作為治療應用的研究進展14-19
• 1.1 噬菌體概述14-15
• 1.2 噬菌體的應用要求15
• 1.3 噬菌體治療的限制與缺點15-16
• 1.4 噬菌體的“雞尾酒”療法16-17
• 1.5 噬菌體與抗生素的聯(lián)合應用17
• 1.6 噬菌體制劑的應用研究17-19
• 第二章 噬菌體裂解酶的研究進展19-24
• 2.1 裂解酶概述19-20
• 2.2 裂解酶結構20
• 2.3 裂解酶的應用特性20-21
• 2.4 裂解酶的協(xié)同作用21
• 2.5 嵌合裂解酶的應用研究21-22
• 2.6 裂解酶的應用22-24
• 第二篇 研究內(nèi)容24-70
• 第一章 屎腸球菌及其噬菌體的分離與鑒定24-42
• 1.1 材料24-26
• 1.2 方法26-30
• 1.3 結果30-40
• 1.4 討論40-41
• 1.5 小結41-42
• 第二章 噬菌體IME-EFm5全基因組測序與分析42-53
• 2.1 材料42-43
• 2.2 方法43-44
• 2.3 結果44-51
• 2.4 討論51-52
• 2.5 小結52-53
• 第三章 裂解酶LysEFm5的原核表達與活性測定53-61
• 3.1 材料53-54
• 3.2 方法54-56
• 3.3 結果56-60
• 3.4 討論60
• 3.5 小結60-61
• 第四章 裂解酶LysEFm5關鍵作用位點的研究61-70
• 4.1 材料61-62
• 4.2 方法62-63
• 4.3 結果63-68
• 4.4 討論68-69
• 4.5 小結69-70
• 結論70-71
• 參考文獻71-80
• 導師簡介80-81
• 作者簡介81-82
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文82-83
• 致謝83

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