【摘要】：乳腺炎通常是由微生物感染乳腺所引發(fā)的炎性反應(yīng)，是造成奶牛業(yè)損失的重大疾病。乳腺炎造成的損失中70%為產(chǎn)奶量下降，常歸咎于乳腺組織損傷所引起的上皮細(xì)胞數(shù)量和活性的降低。梔子苷以其抗炎、抗氧化等藥理作用被廣泛應(yīng)用，本研究利用原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞、小鼠乳腺上皮細(xì)胞及小鼠乳腺炎動物模型，研究了梔子苷對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎性損傷的保護(hù)作用，以期為梔子苷應(yīng)用于臨床治療奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)。 首先，利用組織塊法和差速消化法，分離純化原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，，梔子苷預(yù)處理后給予LPS刺激，MTT法檢測梔子苷對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的毒性作用，qRT-PCR檢測梔子苷對奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的影響，LIVE/DEAD檢測梔子苷對奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活情況的影響。結(jié)果顯示，梔子苷在0-200μg/ml濃度時對奶牛乳腺上皮細(xì)胞沒有毒性作用；梔子苷能夠顯著降低由LPS刺激引發(fā)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)的升高；明顯減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 其次，利用混合酶消化法，分離純化原代小鼠乳腺上皮細(xì)胞，梔子苷預(yù)處理后給予LPS刺激，MTT法檢測梔子苷對小鼠乳腺上皮細(xì)胞的毒性作用，ELISA檢測梔子苷對乳腺上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響，LIVE/DEAD檢測梔子苷對小鼠乳腺上皮細(xì)胞存活情況的影響，Western Blot檢測梔子苷對NF-κB、MAPKs信號通路及Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53和TLR4蛋白表達(dá)的影響。qRT-PCR檢測梔子苷對TNF-α、IL-1β、IL-6等蛋白的mRNA水平的影響，結(jié)果顯示，梔子苷在0-100μg/ml濃度時對小鼠乳腺上皮細(xì)胞沒有毒性作用；梔子苷能夠顯著降低由LPS刺激引發(fā)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)升高；明顯減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，減少TLR4的表達(dá)，抑制NF-κB、MAPKs信號通路的激活，顯著下調(diào)Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Caspase-3的裂解和p53的磷酸化。 最后，為進(jìn)一步驗證梔子苷抗LPS誘導(dǎo)的乳腺炎性損傷效果，實驗利用乳導(dǎo)管灌注LPS建立小鼠乳腺炎模型，通過ELISA檢測梔子苷對乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響，H.E.染色檢測梔子苷對乳腺組織病理組織學(xué)變化的影響，TUNEL檢測梔子苷對LPS誘導(dǎo)的乳腺組織凋亡的影響。結(jié)果顯示，梔子苷能夠顯著減少乳腺組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，保護(hù)乳腺結(jié)構(gòu)的正常及完整性，減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織的凋亡。 綜上所述，本研究表明梔子苷通過減少TLR4的表達(dá)，抑制NF-κB、MAPKs信號通路的激活，顯著下調(diào)Bax的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Caspase-3的裂解活化和p53的磷酸化，從而發(fā)揮對LPS誘導(dǎo)的炎性損傷保護(hù)作用，且具有良好的效果。表明梔子苷是一個潛在治療大腸桿菌性奶牛乳腺炎的藥物，也許未來會應(yīng)用于奶牛乳腺炎的治療。
【圖文】：

圖 2-1 梔子苷的分子結(jié)構(gòu)式Fig.2-1 The molecular structure of genipos作用雞卵清蛋白（Ova）誘導(dǎo) BALB/c 小鼠建20、40、80 mg/kg）治療，結(jié)果表明IL-5、IL-13）及血清 IgE 水平，減輕嗜高反應(yīng)性、黏液分泌過多及特異性 IgE其機(jī)制與阻斷 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的鼻腔滴注 LPS 建立肺損傷模型，給予可降低小鼠肺干濕比（W/D 值）；改細(xì)胞浸潤；抑制炎性細(xì)胞因子 TNF-α

4.吸取每孔細(xì)胞培養(yǎng)基，加入 2ml 染色混合液，37℃孵育 15min 后，于免熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況。1.2.6 數(shù)據(jù)分析利用 GraphPad Prism5 軟件對實驗所獲得的所有數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行 one-wANOVA 或 Student’s t-test 分析。P<0.05 即具有顯著性差異。1.3 結(jié)果1.3.1 原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞鑒定采用組織塊培養(yǎng)法及差速消化法獲得純化的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，利用乳動物上皮細(xì)胞陽性表達(dá)角蛋白-18 這一特性，對分離的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)免疫熒光鑒定。結(jié)果如圖 1-1 所示，細(xì)胞胞漿被染成綠色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色表明分離的細(xì)胞為奶牛乳腺上皮細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S853.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2579441