本文關(guān)鍵詞：利用單個(gè)細(xì)胞RT-PCR法克隆全人源性HBV單克隆抗體的探討

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【摘要】：目的建立外周血單個(gè)抗體分泌細(xì)胞分離和單個(gè)細(xì)胞RT-PCR系統(tǒng),高效快速克隆高度特異性、全人源性的HBV單克隆抗體。方法選擇3例HBV感染恢復(fù)期患者,從外周血中富集B淋巴細(xì)胞,加入HBcAg Peptide pool活化B淋巴細(xì)胞,流式分選出記憶性抗體分泌細(xì)胞(CD19~+CD10~-IgG~+CD27~+),通過(guò)有限稀釋法獲得單個(gè)細(xì)胞,單細(xì)胞RT-PCR反轉(zhuǎn)出cDNA,巢式PCR擴(kuò)增抗體重鏈恒定區(qū)序列片段,將PCR產(chǎn)物純化并克隆至pEASY~汶-T1 simple克隆載體,進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果 ELISA結(jié)果顯示,3例HBV感染恢復(fù)期患者血漿中均檢測(cè)到較高水平IgG,與健康志愿者相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)。流式結(jié)果顯示,B淋巴細(xì)胞比例均高于94%,且均可分離出記憶性抗體分泌細(xì)胞。從分離的抗體分泌細(xì)胞中挑選出24個(gè)含有1個(gè)形態(tài)完好的細(xì)胞,經(jīng)鑒定,其中有14個(gè)擴(kuò)增成功,且條帶在200 bp左右,與預(yù)期片段大小相符。對(duì)抗體重鏈序列分析顯示成功擴(kuò)增出抗體恒定區(qū)片段。結(jié)論成功構(gòu)建了單個(gè)抗體分泌細(xì)胞分離和單個(gè)細(xì)胞RT-PCR系統(tǒng),獲得了抗體重鏈序列,為后期全人源性乙型肝炎單克隆抗體的高通量生產(chǎn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【作者單位】： 吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院;吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科;
【關(guān)鍵詞】： 肝炎病毒 乙型 抗體生成細(xì)胞 抗體 單克隆 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
【基金】：科技部“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治項(xiàng)目子課題(2013ZX10004609-004) 吉林省發(fā)展與改革委員會(huì)項(xiàng)目(2014N147)
【分類號(hào)】：R512.62
【正文快照】： 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球約有20億人感染HBV,其中超過(guò)3.6億發(fā)展成慢性HBV感染,每年超過(guò)100萬(wàn)人死于HBV感染導(dǎo)致的肝癌或終末期肝病。我國(guó)HBV攜帶者高達(dá)9300萬(wàn)人,其中3000萬(wàn)人為慢性HBV感染,其結(jié)果為肝硬化、肝衰竭和肝癌[1-2]。目前,接種乙型肝炎疫苗是預(yù)防HBV感染最有效的措

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：981210