本文關(guān)鍵詞：白念珠菌ADH1缺失株對氟康唑的MIC及其外排泵相關(guān)機制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 白念珠菌 ADH1基因 MIC 耐藥性 外排泵

【摘要】：目的:探討白念珠菌(Candida albicans)ADH1(alcohol dehydrogenase I)基因缺失后對氟康唑(fluconazole,FLC)的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的影響,并進而探討其變化是否與外排泵機制相關(guān)。方法:以白念珠菌SC5314株、以其為親本構(gòu)建的白念珠菌ADH1基因缺失株EX2與回復(fù)株RE1為研究對象,按照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)M27-A3方案的微量稀釋法測定FLC作用對這三株白念珠菌酵母相的MIC水平,以考察ADH1基因缺失后菌細胞對FLC的體外敏感性變化;并同時通過瓊脂點板實驗(spot assay)測定菌細胞對FLC的藥物敏感性變化,以比較其在固體培養(yǎng)基上的結(jié)果與上述MIC值是否一致。通過羅丹明123的蓄積/外排實驗測定FLC存在時三株菌株外排泵功能差異;并通過RT-PCR技術(shù)測定FLC作用對菌株外排泵相關(guān)基因(CDR1、CDR2、MDR1)在m RNA水平的表達情況差異,以考察ADH1基因缺失對白念珠菌外排泵功能及主要外排泵耐藥基因表達的影響。通過檢測線粒體膜電位、細胞內(nèi)ATP水平初步考察ADH1基因敲除后對FLC敏感性的影響是否與能量代謝相關(guān)。結(jié)果:1.微量稀釋法結(jié)果顯示,白念珠菌ADH1缺失株EX2對FLC的MIC較親本株SC5314及回復(fù)株RE1均降低,其中72小時后MIC50、MIC80均下降兩個梯度,48小時后MIC50、MIC80均下降一個梯度;親本株SC5314與回復(fù)株RE1之間對FLC的MIC50、MIC80在48小時、72小時均無差異。瓊脂點板實驗結(jié)果亦顯示,ADH1缺失株EX2對FLC的敏感性較親本株SC5314、回復(fù)株RE1升高,親本株SC5314與回復(fù)株RE1之間對FLC的敏感性無明顯差異。2.蓄積實驗后,缺失株EX2細胞內(nèi)羅丹明123陽性細胞百分比分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的2.09倍及1.67倍(P0.05),EX2對羅丹明123的蓄積增加;外排實驗后,缺失株EX2細胞內(nèi)的羅丹明123陽性細胞百分比分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的2.27倍及2.13倍(P0.05),EX2對羅丹明123的外排減少。親本株SC5314及回復(fù)株RE1之間對羅丹明123的蓄積與外排均無明顯差異(P0.05)。3.RT-PCR結(jié)果表明,ADH1缺失株EX2 MDR1基因在m RNA水平的表達分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的0.32倍、0.29倍(P0.05),CDR2基因在m RNA水平的表達分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的3.10倍、2.12倍(P0.05),CDR1基因在m RNA水平的表達分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的1.42倍及1.18倍(P0.05)。缺失株EX2中外排泵基因CDR2表達上升,MDR1表達下降,CDR1基因表達無明顯差異。親本株SC5314與回復(fù)株RE1之間外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1在m RNA水平的表達均無明顯差異(P0.05)。4.ADH1缺失株EX2、親本株SC5314、回復(fù)株RE1的線粒體膜電位熒光比值分別為7.93、12.84、11.47,其中缺失株EX2較親本株SC5314及回復(fù)株RE1線粒體膜電位均降低(P0.05),親本株SC5314與回復(fù)株RE1線粒體膜電位無明顯差異(P0.05)。5.ADH1缺失株EX2、親本株SC5314、回復(fù)株RE1細胞內(nèi)ATP水平分別為374.51n M、568.82 n M、517.94 n M,缺失株EX2細胞內(nèi)ATP水平較親本株SC5314和回復(fù)株RE1均降低(P0.05),親本株SC5314與回復(fù)株RE1的細胞內(nèi)ATP水平無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:ADH1基因可能是參與白念珠菌對氟康唑耐藥的基因,其機制可能與通過影響細胞內(nèi)ATP水平及線粒體膜電位,進而上調(diào)外排泵基因MDR1表達,影響外排泵功能有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 ADH1基因 MIC 耐藥性 外排泵
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R519.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 前言8-14
• 1 白念珠菌的感染耐藥及治療現(xiàn)狀9-10
• 2 白念珠菌對唑類藥物的耐藥機制10-11
• 3 ADH1基因及其耐藥性相關(guān)研究現(xiàn)狀11-13
• 4 本實驗的研究思路方法，，意義以及創(chuàng)新性13-14
• 第一部分 白念珠菌ADH1缺失株對氟康唑的敏感性研究14-22
• 前言14-15
• 1 材料與方法15-18
• 2 實驗結(jié)果18-20
• 3 討論20
• 4 小結(jié)20-22
• 第二部分 白念珠菌ADH1基因缺失后對外排泵及能量代謝的影響22-37
• 前言22
• 1 材料與方法22-28
• 2 實驗結(jié)果28-33
• 3 討論33-36
• 4 小結(jié)36-37
• 全文討論37-38
• 結(jié)論38-39
• 縮略詞表39-40
• 參考文獻40-44
• 附錄44-45
• 致謝45

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