本文關(guān)鍵詞：小鼠Prdx6與布魯氏菌胞內(nèi)寄生關(guān)系的研究

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【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病),是一種流行范圍廣,對人畜危害大的人獸共患病,我國衛(wèi)生部將其列為二類傳染病。布魯氏菌(Brucella)作為該病的病原菌,目前已知的易感動物達(dá)60多種,其中主要為綿羊,豬和牛等,感染動物可出現(xiàn)流產(chǎn)、不育等癥狀,人感染布魯氏菌后主要表現(xiàn)為持續(xù)性間歇性發(fā)熱,關(guān)節(jié)疼痛等。布魯氏菌可以在宿主細(xì)胞內(nèi)生存與復(fù)制。布魯氏菌通過皮膚、消化道或呼吸道黏膜進(jìn)入機(jī)體,主要寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi),通過先天和后天免疫逃避機(jī)制,在宿主細(xì)胞內(nèi)生存與繁殖,后轉(zhuǎn)移至部分淋巴結(jié)中,形成原發(fā)性病灶。當(dāng)布魯氏菌胞內(nèi)繁殖達(dá)到一定程度后,使巨噬細(xì)胞破裂,隨血液或淋巴液轉(zhuǎn)移至其他宿主細(xì)胞,期間由于內(nèi)毒素,細(xì)菌莢膜刺激引起機(jī)體發(fā)熱。當(dāng)布魯氏菌定植到新宿主細(xì)胞后,再次進(jìn)行胞內(nèi)寄生,如此循環(huán)往復(fù)寄生-轉(zhuǎn)移-寄生,引發(fā)了布魯氏菌感染后的典型癥狀“波浪熱”。目前,布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的免疫逃避機(jī)制尚不完全清楚,因此,研究布魯氏菌胞內(nèi)寄生相關(guān)蛋白具有重要意義。過氧化物氧還酶6(Peroxiredoxin 6,Prdx6)是非硒依賴性過氧化物酶家族中的一員,Prdx6區(qū)別于家族其它成員,主要在于該蛋白是1-Cys酶,以谷胱甘肽作為電子供體。研究表明Prdx6是一種雙功能蛋白,既有GSH過氧化物酶活性,又具有磷脂酶A2活性,在幫助機(jī)體抵抗氧化損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。前期研究表明,綿羊感染布魯氏菌后,機(jī)體內(nèi)Prdx6出現(xiàn)明顯差異表達(dá),但Prdx6表達(dá)與布魯氏菌之間相互關(guān)系尚不明確。為了探討Prdx6與布魯氏菌胞內(nèi)寄生的關(guān)系,本研究克隆小鼠Prdx6編碼序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體,原核表達(dá)重組Prdx6蛋白并進(jìn)行純化,以純化的Prdx6蛋白制備兔源多克隆抗體及鼠源單克隆抗體,用于后續(xù)檢測。通過布魯氏菌S2弱毒株等細(xì)菌感染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7,分析胞內(nèi)Prdx6表達(dá)變化。通過構(gòu)建Prdx6過表達(dá)載體和sh RNA干擾載體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)Prdx6表達(dá)水平,檢測布魯氏菌感染與胞內(nèi)寄生菌量變化,分析胞內(nèi)Prdx6差異表達(dá)對布魯氏菌感染與寄生的影響。實驗結(jié)果表明克隆小鼠Prdx6編碼序列正確,并成功構(gòu)建小鼠Prdx6原核表達(dá)載體,利用誘導(dǎo)表達(dá)及His標(biāo)簽親和層析純化技術(shù)獲得重組小鼠Prdx6蛋白,并驗證其具有抗氧化活性。以重組小鼠Prdx6蛋白免疫家兔和BALB/c小鼠,制備小鼠Prdx6兔源多克隆抗體和鼠源單克隆抗體,兩種抗體特異性良好。布魯氏菌S2弱毒株感染巨噬細(xì)胞,胞內(nèi)Prdx6表達(dá)水平呈先下降后上升趨勢,表明布魯氏菌感染導(dǎo)致Prdx6差異表達(dá)。通過過表達(dá)提高巨噬細(xì)胞內(nèi)Prdx6表達(dá)水平,可提高布魯氏菌感染量及胞內(nèi)生存能力。以sh RNA干擾降低胞內(nèi)Prdx6表達(dá)水平,可降低布魯氏菌感染量及胞內(nèi)生存能力。本研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體Prdx6差異表達(dá)可影響布魯氏菌感染與胞內(nèi)寄生,宿主細(xì)胞上調(diào)表達(dá)Prdx6有利于布魯氏菌感染及胞內(nèi)生存。為進(jìn)一步研究Prdx6影響布魯氏菌胞內(nèi)寄生作用機(jī)制,及能否以Prdx6為靶標(biāo)有效的預(yù)防和治療布魯氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：過氧化物氧還酶6 布魯氏菌 胞內(nèi)寄生 小鼠 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R516.7
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮寫詞表12-13
• 引言13-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-27
• 第1章 布魯氏菌病的研究進(jìn)展14-22
• 1.1 布魯氏菌病概述14-15
• 1.2 布魯氏菌胞內(nèi)寄生研究進(jìn)展15-18
• 1.3 布魯氏菌病檢測方法的研究進(jìn)展18-20
• 1.4 布魯氏菌病的防控展望20-22
• 第2章 Peroxiredoxin 6 的研究進(jìn)展22-26
• 2.1 Prdx6結(jié)構(gòu)與功能22-23
• 2.2 Prdx6生物體分布23
• 2.3 Prdx6與相關(guān)疾病的研究23-26
• 小結(jié)與展望26-27
• 第二篇 研究內(nèi)容27-81
• 第1章 小鼠Prdx6編碼區(qū)DNA克隆、表達(dá)及活性分析27-44
• 1.1 材料27-32
• 1.2 方法32-38
• 1.3 結(jié)果38-42
• 1.4 討論42-44
• 第2章 小鼠Prdx6多抗及單克隆抗體的制備44-58
• 2.1 材料44-45
• 2.2 方法45-53
• 2.3 結(jié)果53-56
• 2.4 討論56-57
• 2.5 小結(jié)57-58
• 第3章 布魯氏菌感染小鼠巨噬細(xì)胞Prdx6差異表達(dá)分析58-68
• 3.1 材料58-59
• 3.2 方法59-62
• 3.3 結(jié)果62-66
• 3.4 討論66-67
• 3.5 小結(jié)67-68
• 第4章 Prdx6差異表達(dá)對布魯氏菌胞內(nèi)寄生的影響68-81
• 4.1 材料68-69
• 4.2 方法69-71
• 4.3 結(jié)果71-79
• 4.4 討論79-80
• 4.5 小結(jié)80-81
• 結(jié)論81-82
• 參考文獻(xiàn)82-90
• 導(dǎo)師簡介90-91
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果91-92
• 致謝92

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1 陳曉峰;小鼠Prdx6與布魯氏菌胞內(nèi)寄生關(guān)系的研究[D];吉林大學(xué);2016年

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本文編號：814711