本文關鍵詞：我國不同地區(qū)曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴分離株的遺傳多態(tài)性研究

  更多相關文章： 曼氏迭宮絳蟲 裂頭蚴 感染 遺傳多態(tài)性 系統(tǒng)發(fā)育

【摘要】：曼氏迭宮絳蟲是最重要的絳蟲種類之一,其幼蟲—裂頭蚴可以侵入人體皮下組織、腹腔、眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng),導致一種嚴重的人獸共患寄生蟲病——裂頭蚴病。人體感染裂頭蚴病主要是通過食入裂頭蚴感染的蛙肉或蛇肉,誤食感染有原尾蚴的劍水蚤,或用蛙肉、蛇肉(皮)敷貼皮膚的瘡癤、傷口或膿腫等。裂頭蚴病呈全球性分布,但大部分病例分布在東亞和東南亞國家。中國的裂頭蚴病例為世界之最,自1949年以來,在27個省、市、自治區(qū)已有1,000多例報道。近年來裂頭蚴病在我國局部地區(qū)有增加的趨勢,在一些地區(qū),裂頭蚴病已經(jīng)被列為新現(xiàn)的動物源性寄生蟲病。對于裂頭蚴的地理分布、種群遺傳特征與其生態(tài)環(huán)境之間的相互關系的了解,有助于裂頭蚴病的預防和控制。然而,目前有關裂頭蚴種群遺傳結構的研究還十分薄弱。因此,有必要對我國不同地區(qū)裂頭蚴分離株進行遺傳結構分析,從而有助于了解裂頭蚴種群變化及遺傳變異對其致病性的影響。本研究首先對中國西南部9個不同地區(qū)野生蛙類的裂頭蚴自然感染情況進行了調(diào)查。然后,基于4個分子標記(cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1)對這些裂頭蚴分離株的種群遺傳結構進行了分析。在DNA多態(tài)性分析中,不同地區(qū)裂頭蚴分離株之間表現(xiàn)出了高度的遺傳多樣性和遺傳分化;系統(tǒng)發(fā)育推斷和中接網(wǎng)絡分析均支持西南地區(qū)裂頭蚴種群可分為兩個分枝。然而,中性檢驗、岐點分布分析和貝葉斯擴張動力學曲線等分析均未發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)裂頭蚴種群經(jīng)歷過擴張。最后,本研究還對中國東部、中部、南部以及西南地區(qū)的裂頭蚴分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析,認為中國裂頭蚴種群可能存在兩個類群(類群Ⅰ和類群Ⅱ),且這兩個類群在上新世中期開始分化。材料與方法1.裂頭蚴的采集:在2013年5月到2014年9月之間,在我國西南部9個不同地區(qū):四川(廣安、瀘州、綿陽、南充、南充營山)、云南(保山、德宏、昆明)及重慶(梁平)自然感染青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴,放入5ml的凍存管中用無水乙醇保存并做好標記。2.目的基因的擴增及測序:使用通用型柱式基因組提取試劑盒對每一個裂頭蚴分離株進行基因組DNA的提取,然后以基因組DNA為模板,使用PCR方法擴增4個分子標記:cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1,用PCR純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化,將純化后的PCR產(chǎn)物送至金唯智公司進行雙向測序,所有的序列均上傳至Gen Bank數(shù)據(jù)庫。3.序列比對及飽和度分析:首先使用Clustal X v.2.0程序對線粒體基因編碼序列cytb和cox1進行比對。然后根據(jù)其氨基酸序列在MEGA v.5.0中進行校正。對于線粒體核糖體rrn S基因和核糖體28S r DNA D1序列,首先預測其二級結構,然后根據(jù)二級結構在MEGA v.5.0中進行比對。使用DAMBE v 5.2軟件對分子序列進行核酸替代飽和性檢驗。此外,使用MEGA v.5.0來估算核苷酸組成、保守位點、變異位點、簡約信息位點等。4.遺傳結構分析:基于cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1的聯(lián)合序列,使用Dna SP v.5.10進行單倍型(Haplotype)分析,并計算每個種群的遺傳多態(tài)性。使用軟件Network v.4.5中的平均鄰接算法進行單倍型網(wǎng)絡的重建�；诼�(lián)合序列,使用Mr Bayes v.3.1來對西南地區(qū)裂頭蚴分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析�；诼�(lián)合序列,在軟件Arlequin v.3.5.1.2中使用岐點分布分析評估裂頭蚴種群的動態(tài)變化。依據(jù)觀察到的和預測的錯配分布之間的偏差平方和與平滑指數(shù)評估擴張模型的可靠性;同時,基于Fu’s FS檢測和Tajima’s D檢測進行中性檢驗。同樣,使用Arlequin v.3.5.1.2進行分子差異度分析(AMOVA),以檢測種群內(nèi)部和種群之間的遺傳多樣性水平。使用群體遺傳固定系數(shù)(Fst)值評估不同地理種群之間的遺傳差異水平。5.系統(tǒng)發(fā)育分析:分別使用最大簡約法(maximum parsimony,MP)、最大似然法(maximum likelihood,ML)和貝葉斯推斷法(Bayesian inference,BI)對我國東部、中部、南部和西南地區(qū)裂頭蚴分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。最大簡約法在MEGA v.5.0中進行,系統(tǒng)樹每一分枝的置信度采用自引導法重復檢驗,設置1000次重復;使用Phy ML軟件進行最大似然分析;貝葉斯分析采用Mr Bayes v3.1軟件進行;所有系統(tǒng)發(fā)育分析均運算兩次。使用BEAST v1.6.1軟件,基于松弛分子鐘模型對cytb+cox1聯(lián)合數(shù)據(jù)集對我國不同地區(qū)裂頭蚴的分化時間進行估算。結果1.中國西南地區(qū)野生蛙類裂頭蚴自然感染率:從中國西南部9個不同地區(qū)共采集野生蛙類276只,經(jīng)形態(tài)學鑒定均為黑斑蛙(Rana nigromaculata)。在276只黑斑蛙中,55只發(fā)現(xiàn)有裂頭蚴寄生,平均感染率為19.93%。西南不同地區(qū)野生黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴的感染率從8.33%到50.00%不等,最多的1只蛙體內(nèi)可有31條裂頭蚴寄生,最少的每只蛙有1條裂頭蚴感染。四川地區(qū)蛙類裂頭蚴的感染率高于其他地區(qū),其中,四川南充地區(qū)黑斑蛙蛙的裂頭蚴感染率最高,達到50.00%,感染強度為每只蛙有1~23條裂頭蚴感染。2.裂頭蚴DNA序列多態(tài)性:4個目的基因(cytb、cox1、rrns和28S r DNA D1)均得到成功擴增,其長度分別為1110 bp、1566 bp、280 bp和299 bp,且這些序列均未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象,表明其適用于系統(tǒng)發(fā)育研究。4個基因聯(lián)合序列(cytb+cox1+rrn S+28S)共鑒定出180個多態(tài)位點,其中161個是簡約性信息位點,有19個是單一變異位點;在來自9個不同地理區(qū)域的52個裂頭蚴地理株中,共鑒定出32個單倍型。每一地理種群及整個裂頭蚴種群均具有較高的單倍型多態(tài)性。3.西南地區(qū)裂頭蚴種群遺傳結構:分子差異度分析(AMOVA)的結果顯示裂頭蚴種群之間的遺傳差異度為57.31%,比種群內(nèi)的(42.69%)要高一些。除了四川廣安和四川綿陽之間及四川廣安和四川南充之間的Fst值小于0.25以外,其他地區(qū)之間的群體遺傳固定系數(shù)值均在0.25以上。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示我國西南地區(qū)裂頭蚴分離株可分為兩個主要的分枝(分枝Ⅰ和分枝Ⅱ)�；趩伪缎吐�(lián)合序列的中接鄰接網(wǎng)絡分析的結果同樣顯示,我國西南地區(qū)的裂頭蚴存在兩個單倍型子網(wǎng)絡。基于寬松分子鐘模型的分化時間估算表明,我國西南地區(qū)的裂頭蚴分離株在上新世中期(2.91 Myr)開始分化。分枝Ⅰ的起源時間大約在上新世晚期(1.88 Myr),分枝Ⅱ在更新世早期(1.56Myr)開始分化。岐點分布分析結果顯示,分枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整個種群的分布曲線均呈多峰分布狀態(tài),表明西南地區(qū)種群處于平衡階段。貝葉斯擴張動力學曲線分析的結果同樣不支持枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整個種群存在明顯的種群擴張。4.系統(tǒng)發(fā)育分析及分化時間估算:我國裂頭蚴種群可分為兩個主要類群:類群Ⅰ和類群Ⅱ,且這兩個種群在上新世中期開始分化。所有來自河南、湖南、安徽、浙江及重慶的裂頭蚴分離株均包含在類群Ⅰ中,類群Ⅰ大約在1.67 Myr(上新世晚期)開始分化。類群Ⅱ包含的裂頭蚴分離株主要來自云南、海南和廣西,此類群的起源時間被估算為上新世晚期(1.89Myr)。來自貴州、江蘇和四川的分離株在兩個分枝中均有分布。結論1.DNA多態(tài)性分析結果顯示我國西南不同地區(qū)裂頭蚴種群的遺傳多態(tài)性及遺傳差異均比較高;基于多基因聯(lián)合序列(cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1)的系統(tǒng)發(fā)育推斷及中接鄰接網(wǎng)絡分析均表明我國西南地區(qū)的裂頭蚴種群可分為兩個主要分枝。2.對我國東部、中部、南部和西南地區(qū)的裂頭蚴分離株進行的系統(tǒng)發(fā)育分析及分化時間估算結果表明,我國的裂頭蚴種群可以分為類群Ⅰ和類群Ⅱ兩個主要類群,且這兩個類群在上新世中期開始分化。
【關鍵詞】：曼氏迭宮絳蟲 裂頭蚴 感染 遺傳多態(tài)性 系統(tǒng)發(fā)育
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R532.3
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-16
• 英文縮略詞表(Abbreviations)16-17
• 1 前言17-21
• 1.1 裂頭蚴及裂頭蚴病17-18
• 1.2 裂頭蚴的鑒定及遺傳多樣性18-20
• 1.3 目的和意義20-21
• 2 材料和方法21-34
• 2.1 試劑21
• 2.2 儀器21-22
• 2.3 溶液的配置22
• 2.3.1 0.1mol/L PBS (pH 7.4)22
• 2.3.2 50×TAE緩沖液22
• 2.4 曼氏裂頭蚴的采集與分離22-23
• 2.5 目的基因的獲取23-30
• 2.5.1 裂頭蚴基因組DNA的提取23-24
• 2.5.2 目的基因的擴增24-25
• 2.5.3 測序及序列上傳25-30
• 2.6 數(shù)據(jù)分析30-34
• 2.6.1 序列比對30-31
• 2.6.2 遺傳結構分析31-32
• 2.6.3 系統(tǒng)發(fā)育分析32-33
• 2.6.4 統(tǒng)計分析33-34
• 3 結果34-46
• 3.1 蛙體內(nèi)裂頭蚴自然感染情況34-35
• 3.2 目的基因的序列多態(tài)性35-37
• 3.3 裂頭蚴種群遺傳結構37-41
• 3.4 中國裂頭蚴分離株的系統(tǒng)發(fā)育模式及分化時間估計時間估算41-46
• 4 討論46-49
• 5 結論49-50
• 參考文獻50-56
• 綜述 微衛(wèi)星標記在寄生蟲種群遺傳多態(tài)性研究中的應用56-71
• 參考文獻64-71
• 個人簡歷及發(fā)表的論文71-72
• 致謝72

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