本文關(guān)鍵詞：我國(guó)不同地區(qū)曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴分離株的遺傳多態(tài)性研究

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【摘要】：曼氏迭宮絳蟲是最重要的絳蟲種類之一,其幼蟲—裂頭蚴可以侵入人體皮下組織、腹腔、眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病——裂頭蚴病。人體感染裂頭蚴病主要是通過(guò)食入裂頭蚴感染的蛙肉或蛇肉,誤食感染有原尾蚴的劍水蚤,或用蛙肉、蛇肉(皮)敷貼皮膚的瘡癤、傷口或膿腫等。裂頭蚴病呈全球性分布,但大部分病例分布在東亞和東南亞國(guó)家。中國(guó)的裂頭蚴病例為世界之最,自1949年以來(lái),在27個(gè)省、市、自治區(qū)已有1,000多例報(bào)道。近年來(lái)裂頭蚴病在我國(guó)局部地區(qū)有增加的趨勢(shì),在一些地區(qū),裂頭蚴病已經(jīng)被列為新現(xiàn)的動(dòng)物源性寄生蟲病。對(duì)于裂頭蚴的地理分布、種群遺傳特征與其生態(tài)環(huán)境之間的相互關(guān)系的了解,有助于裂頭蚴病的預(yù)防和控制。然而,目前有關(guān)裂頭蚴種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究還十分薄弱。因此,有必要對(duì)我國(guó)不同地區(qū)裂頭蚴分離株進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,從而有助于了解裂頭蚴種群變化及遺傳變異對(duì)其致病性的影響。本研究首先對(duì)中國(guó)西南部9個(gè)不同地區(qū)野生蛙類的裂頭蚴自然感染情況進(jìn)行了調(diào)查。然后,基于4個(gè)分子標(biāo)記(cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1)對(duì)這些裂頭蚴分離株的種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。在DNA多態(tài)性分析中,不同地區(qū)裂頭蚴分離株之間表現(xiàn)出了高度的遺傳多樣性和遺傳分化;系統(tǒng)發(fā)育推斷和中接網(wǎng)絡(luò)分析均支持西南地區(qū)裂頭蚴種群可分為兩個(gè)分枝。然而,中性檢驗(yàn)、岐點(diǎn)分布分析和貝葉斯擴(kuò)張動(dòng)力學(xué)曲線等分析均未發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)裂頭蚴種群經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張。最后,本研究還對(duì)中國(guó)東部、中部、南部以及西南地區(qū)的裂頭蚴分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,認(rèn)為中國(guó)裂頭蚴種群可能存在兩個(gè)類群(類群Ⅰ和類群Ⅱ),且這兩個(gè)類群在上新世中期開始分化。材料與方法1.裂頭蚴的采集:在2013年5月到2014年9月之間,在我國(guó)西南部9個(gè)不同地區(qū):四川(廣安、瀘州、綿陽(yáng)、南充、南充營(yíng)山)、云南(保山、德宏、昆明)及重慶(梁平)自然感染青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴,放入5ml的凍存管中用無(wú)水乙醇保存并做好標(biāo)記。2.目的基因的擴(kuò)增及測(cè)序:使用通用型柱式基因組提取試劑盒對(duì)每一個(gè)裂頭蚴分離株進(jìn)行基因組DNA的提取,然后以基因組DNA為模板,使用PCR方法擴(kuò)增4個(gè)分子標(biāo)記:cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1,用PCR純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,將純化后的PCR產(chǎn)物送至金唯智公司進(jìn)行雙向測(cè)序,所有的序列均上傳至Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)。3.序列比對(duì)及飽和度分析:首先使用Clustal X v.2.0程序?qū)�粒體基因編碼序列cytb和cox1進(jìn)行比對(duì)。然后根據(jù)其氨基酸序列在MEGA v.5.0中進(jìn)行校正。對(duì)于線粒體核糖體rrn S基因和核糖體28S r DNA D1序列,首先預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu),然后根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)在MEGA v.5.0中進(jìn)行比對(duì)。使用DAMBE v 5.2軟件對(duì)分子序列進(jìn)行核酸替代飽和性檢驗(yàn)。此外,使用MEGA v.5.0來(lái)估算核苷酸組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等。4.遺傳結(jié)構(gòu)分析:基于cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1的聯(lián)合序列,使用Dna SP v.5.10進(jìn)行單倍型(Haplotype)分析,并計(jì)算每個(gè)種群的遺傳多態(tài)性。使用軟件Network v.4.5中的平均鄰接算法進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)的重建�；诼�(lián)合序列,使用Mr Bayes v.3.1來(lái)對(duì)西南地區(qū)裂頭蚴分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析�；诼�(lián)合序列,在軟件Arlequin v.3.5.1.2中使用岐點(diǎn)分布分析評(píng)估裂頭蚴種群的動(dòng)態(tài)變化。依據(jù)觀察到的和預(yù)測(cè)的錯(cuò)配分布之間的偏差平方和與平滑指數(shù)評(píng)估擴(kuò)張模型的可靠性;同時(shí),基于Fu’s FS檢測(cè)和Tajima’s D檢測(cè)進(jìn)行中性檢驗(yàn)。同樣,使用Arlequin v.3.5.1.2進(jìn)行分子差異度分析(AMOVA),以檢測(cè)種群內(nèi)部和種群之間的遺傳多樣性水平。使用群體遺傳固定系數(shù)(Fst)值評(píng)估不同地理種群之間的遺傳差異水平。5.系統(tǒng)發(fā)育分析:分別使用最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony,MP)、最大似然法(maximum likelihood,ML)和貝葉斯推斷法(Bayesian inference,BI)對(duì)我國(guó)東部、中部、南部和西南地區(qū)裂頭蚴分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。最大簡(jiǎn)約法在MEGA v.5.0中進(jìn)行,系統(tǒng)樹每一分枝的置信度采用自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗(yàn),設(shè)置1000次重復(fù);使用Phy ML軟件進(jìn)行最大似然分析;貝葉斯分析采用Mr Bayes v3.1軟件進(jìn)行;所有系統(tǒng)發(fā)育分析均運(yùn)算兩次。使用BEAST v1.6.1軟件,基于松弛分子鐘模型對(duì)cytb+cox1聯(lián)合數(shù)據(jù)集對(duì)我國(guó)不同地區(qū)裂頭蚴的分化時(shí)間進(jìn)行估算。結(jié)果1.中國(guó)西南地區(qū)野生蛙類裂頭蚴自然感染率:從中國(guó)西南部9個(gè)不同地區(qū)共采集野生蛙類276只,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定均為黑斑蛙(Rana nigromaculata)。在276只黑斑蛙中,55只發(fā)現(xiàn)有裂頭蚴寄生,平均感染率為19.93%。西南不同地區(qū)野生黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴的感染率從8.33%到50.00%不等,最多的1只蛙體內(nèi)可有31條裂頭蚴寄生,最少的每只蛙有1條裂頭蚴感染。四川地區(qū)蛙類裂頭蚴的感染率高于其他地區(qū),其中,四川南充地區(qū)黑斑蛙蛙的裂頭蚴感染率最高,達(dá)到50.00%,感染強(qiáng)度為每只蛙有1~23條裂頭蚴感染。2.裂頭蚴DNA序列多態(tài)性:4個(gè)目的基因(cytb、cox1、rrns和28S r DNA D1)均得到成功擴(kuò)增,其長(zhǎng)度分別為1110 bp、1566 bp、280 bp和299 bp,且這些序列均未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象,表明其適用于系統(tǒng)發(fā)育研究。4個(gè)基因聯(lián)合序列(cytb+cox1+rrn S+28S)共鑒定出180個(gè)多態(tài)位點(diǎn),其中161個(gè)是簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn),有19個(gè)是單一變異位點(diǎn);在來(lái)自9個(gè)不同地理區(qū)域的52個(gè)裂頭蚴地理株中,共鑒定出32個(gè)單倍型。每一地理種群及整個(gè)裂頭蚴種群均具有較高的單倍型多態(tài)性。3.西南地區(qū)裂頭蚴種群遺傳結(jié)構(gòu):分子差異度分析(AMOVA)的結(jié)果顯示裂頭蚴種群之間的遺傳差異度為57.31%,比種群內(nèi)的(42.69%)要高一些。除了四川廣安和四川綿陽(yáng)之間及四川廣安和四川南充之間的Fst值小于0.25以外,其他地區(qū)之間的群體遺傳固定系數(shù)值均在0.25以上。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示我國(guó)西南地區(qū)裂頭蚴分離株可分為兩個(gè)主要的分枝(分枝Ⅰ和分枝Ⅱ)�；趩伪缎吐�(lián)合序列的中接鄰接網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果同樣顯示,我國(guó)西南地區(qū)的裂頭蚴存在兩個(gè)單倍型子網(wǎng)絡(luò)�；趯捤煞肿隅娔Ｐ偷姆只瘯r(shí)間估算表明,我國(guó)西南地區(qū)的裂頭蚴分離株在上新世中期(2.91 Myr)開始分化。分枝Ⅰ的起源時(shí)間大約在上新世晚期(1.88 Myr),分枝Ⅱ在更新世早期(1.56Myr)開始分化。岐點(diǎn)分布分析結(jié)果顯示,分枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整個(gè)種群的分布曲線均呈多峰分布狀態(tài),表明西南地區(qū)種群處于平衡階段。貝葉斯擴(kuò)張動(dòng)力學(xué)曲線分析的結(jié)果同樣不支持枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整個(gè)種群存在明顯的種群擴(kuò)張。4.系統(tǒng)發(fā)育分析及分化時(shí)間估算:我國(guó)裂頭蚴種群可分為兩個(gè)主要類群:類群Ⅰ和類群Ⅱ,且這兩個(gè)種群在上新世中期開始分化。所有來(lái)自河南、湖南、安徽、浙江及重慶的裂頭蚴分離株均包含在類群Ⅰ中,類群Ⅰ大約在1.67 Myr(上新世晚期)開始分化。類群Ⅱ包含的裂頭蚴分離株主要來(lái)自云南、海南和廣西,此類群的起源時(shí)間被估算為上新世晚期(1.89Myr)。來(lái)自貴州、江蘇和四川的分離株在兩個(gè)分枝中均有分布。結(jié)論1.DNA多態(tài)性分析結(jié)果顯示我國(guó)西南不同地區(qū)裂頭蚴種群的遺傳多態(tài)性及遺傳差異均比較高;基于多基因聯(lián)合序列(cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1)的系統(tǒng)發(fā)育推斷及中接鄰接網(wǎng)絡(luò)分析均表明我國(guó)西南地區(qū)的裂頭蚴種群可分為兩個(gè)主要分枝。2.對(duì)我國(guó)東部、中部、南部和西南地區(qū)的裂頭蚴分離株進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析及分化時(shí)間估算結(jié)果表明,我國(guó)的裂頭蚴種群可以分為類群Ⅰ和類群Ⅱ兩個(gè)主要類群,且這兩個(gè)類群在上新世中期開始分化。
【關(guān)鍵詞】：曼氏迭宮絳蟲 裂頭蚴 感染 遺傳多態(tài)性 系統(tǒng)發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R532.3
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-16
• 英文縮略詞表(Abbreviations)16-17
• 1 前言17-21
• 1.1 裂頭蚴及裂頭蚴病17-18
• 1.2 裂頭蚴的鑒定及遺傳多樣性18-20
• 1.3 目的和意義20-21
• 2 材料和方法21-34
• 2.1 試劑21
• 2.2 儀器21-22
• 2.3 溶液的配置22
• 2.3.1 0.1mol/L PBS (pH 7.4)22
• 2.3.2 50×TAE緩沖液22
• 2.4 曼氏裂頭蚴的采集與分離22-23
• 2.5 目的基因的獲取23-30
• 2.5.1 裂頭蚴基因組DNA的提取23-24
• 2.5.2 目的基因的擴(kuò)增24-25
• 2.5.3 測(cè)序及序列上傳25-30
• 2.6 數(shù)據(jù)分析30-34
• 2.6.1 序列比對(duì)30-31
• 2.6.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析31-32
• 2.6.3 系統(tǒng)發(fā)育分析32-33
• 2.6.4 統(tǒng)計(jì)分析33-34
• 3 結(jié)果34-46
• 3.1 蛙體內(nèi)裂頭蚴自然感染情況34-35
• 3.2 目的基因的序列多態(tài)性35-37
• 3.3 裂頭蚴種群遺傳結(jié)構(gòu)37-41
• 3.4 中國(guó)裂頭蚴分離株的系統(tǒng)發(fā)育模式及分化時(shí)間估計(jì)時(shí)間估算41-46
• 4 討論46-49
• 5 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 綜述 微衛(wèi)星標(biāo)記在寄生蟲種群遺傳多態(tài)性研究中的應(yīng)用56-71
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表的論文71-72
• 致謝72

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