本文關鍵詞：P-gp和MRP1與日本血吸蟲吡喹酮抗藥性的相關性研究

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【摘要】：血吸蟲病是流行于亞非拉發(fā)展中國家的嚴重危害人民健康、阻礙經(jīng)濟發(fā)展的重大傳染病,僅在撒哈拉以南的非洲,每年因血吸蟲病死亡的人數(shù)就超過20萬(WHO,2012)。在我國,目前血吸蟲主要流行于長江中下游江湖洲灘地區(qū)和四川云南兩省山區(qū)。近年來,血吸蟲病一直被我國政府列為重點控制的四大傳染病之一(艾滋病、乙型肝炎、結核和血吸蟲病)。吡喹酮自上世紀70年代被研發(fā)以來,已成為抗蠕蟲藥物的理想選擇,由于安全高效、使用方便、不良反應少和價格低廉等特點,被WHO推薦為人體血吸蟲病治療的首選藥物。自研發(fā)使用至今,全世界接受吡喹酮抗蟲治療的高危易感人群平均每年超過3000萬。同一種藥物現(xiàn)場大規(guī)模持續(xù)使用被認為會導致病原體抗藥性的產(chǎn)生。曼氏血吸蟲抗性株實驗室的成功誘導,引起了全球血吸蟲病防治研究者和WHO對曼氏血吸蟲吡喹酮抗性的高度重視。在我國對日本血吸蟲進行實驗室藥物選擇同樣誘導出了抗性株,使日本血吸蟲吡喹酮抗性成為我國血吸蟲控制必須重視的問題,對日本血吸蟲吡喹酮抗性機制的研究已迫在眉睫。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多重抗性相關蛋白1(multidrug resistance associated protein 1,MRP1)是最早被發(fā)現(xiàn)的兩個ABC轉(zhuǎn)運蛋白,其主要生理功能是依賴于ATP將氨基酸、糖類、脂類、無機離子、多糖、金屬離子、多肽類以及有毒物質(zhì)等各類生物分子經(jīng)細胞膜進行主動轉(zhuǎn)運。哺乳動物的腫瘤細胞可通過增加P-gp和MRP1等ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達降低抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)的積聚,從而達到抵抗藥物殺傷的作用,即產(chǎn)生多重抗藥性。已有研究證實曼氏血吸蟲對抗蟲藥吡喹酮抗性的產(chǎn)生亦與P-gp和MRP1表達相關,認為這兩種轉(zhuǎn)運蛋白的表達上調(diào)可能參與了曼氏血吸蟲的吡喹酮抗性機制。鑒于目前尚無P-gp和MRP1表達與日本血吸蟲吡喹酮抗性的相關性進行過研究,本課題擬從基因水平通過采用分子生物學相關技術,去確定日本血吸蟲的P-gp和MRP1基因是否存在,并且通過比較日本血吸蟲抗性株和敏感株的P-gp和MRP1基因的表達差異,以及日本血吸蟲在亞致死劑量吡喹酮刺激后這兩個蛋白基因的表達變化,來探索日本血吸蟲吡喹酮抗性與P-gp和MRP1表達相關性,為日本血吸蟲吡喹酮抗性機制的深入研究提供基礎。研究內(nèi)容主要分為以下四個部分:第一部分日本血吸蟲成蟲P-gp和MRP1基因的擴增與鑒定目的:確定在日本血吸蟲體內(nèi)是否存在編碼P-gp和MRP1基因。方法:通過查閱文獻獲得曼氏血吸蟲P-gp基因SMDR2的編碼區(qū)(CDS)和MRP1基因Sm MRP1的CDS,利用Genebank的核酸序列比對功能查找出相應的日本血吸蟲P-gp基因的CDS;并且通過生物信息科學數(shù)據(jù)共享平臺上的日本血吸蟲數(shù)據(jù)庫中,利用核酸序列比對功能查找出相應的疑似日本血吸蟲MRP1基因的CDS。依據(jù)上述取得的日本血吸蟲P-gp和MRP1基因序列,采用Primer Premier 6和Oligo7軟件設計特異性引物。從日本血吸蟲感染小鼠門靜脈和腸系膜靜脈收集成蟲,提取成蟲總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,以設計的引物進行PCR擴增,并行2%瓊脂糖凝膠電泳得到擴增條帶。進行熒光定量PCR,繪制目的基因和內(nèi)參基因的q PCR標準曲線,優(yōu)化引物擴增效率,為后面的熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)的處理提供依據(jù)。結果:通過BLAST功能和核酸序列比對軟件找出了日本血吸蟲P-gp和MRP1基因疑似同源序列,選擇18S為內(nèi)參基因,設計出包括內(nèi)參基因在內(nèi)的3對特異性引物,DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示3個擴增產(chǎn)物大小均和預期大小一致。通過標準曲線計算的擴增效率分別為0.90,1.04和0.96,符合相對定量數(shù)據(jù)處理方法2-ΔΔCT法的要求。結論:日本血吸蟲成蟲體內(nèi)存在編碼P-gp和MRP1的相關基因。第二部分日本血吸蟲成蟲在吡喹酮刺激下P-gp和MRP1基因m RNA的表達變化目的:探討日本血吸蟲成蟲P-gp和MRP1基因的表達水平變化與吡喹酮的相關性。方法與結果:體外實驗方法:采用腹部貼片法感染小鼠,建立日本血吸蟲湖南敏感株感染小鼠模型。小鼠感染尾蚴42天后斷頸解剖,采用抗凝生理鹽水灌注法收集成蟲,并挑選沒有損傷、活力良好的日本血吸蟲成蟲置于RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),向體外培養(yǎng)基實驗組中加入亞致死劑量吡喹酮。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在加藥后0.5h、4h和24h收集實驗組和對照組成蟲,提取各組成蟲總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。分別以各實驗組和對照組的c DNA為模板,進行實時熒光定量PCR實驗檢測P-gp和MRP1 m RNA表達水平。熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。體外實驗結果:熒光定量數(shù)據(jù)分析顯示:日本血吸蟲敏感株成蟲暴露于吡喹酮0.5h后,成蟲P-gp表達量是對照組的2.81倍(P0.05);暴露于吡喹酮4h后,成蟲Pgp表達量與對照組相比略微有所升高,為1.54倍,但并無顯著性差異(P0.05);暴露于吡喹酮24h后,成蟲P-gp表達量返回到基線水平,與對照組相比無顯著性差異(P0.05)。即體外暴露于吡喹酮后,日本血吸蟲成蟲P-gp表達會出現(xiàn)一個短暫性的升高,之后又返回到基線水平。暴露于吡喹酮0.5h后,成蟲MRP1表達量是對照組的2.14倍(P0.05);暴露于吡喹酮4h后,成蟲MRP1表達量與對照組相比仍舊有顯著性升高,是對照組的2.69倍(P0.05);暴露于吡喹酮24h后,成蟲MRP1表達量反而低于對照組水平,為對照組的0.46倍(P0.05)。體外暴露于吡喹酮后,日本血吸蟲成蟲MRP1表達會出現(xiàn)一個短時間內(nèi)升高,隨后又下降的趨勢。體內(nèi)實驗方法:采用腹部貼片法感染,建立日本血吸蟲湖南敏感株感染小鼠模型。將感染小鼠分為用藥0.5h組、用藥4h組、用藥24h組和對照組,每組有3只感染小鼠。用藥組于感染尾蚴后第40天一次灌胃給予75mg/kg劑量吡喹酮。分別在灌胃給藥后0.5h、4h和24h將小鼠斷頸解剖,采用抗凝生理鹽水灌注法收集成蟲,提取各組成蟲總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。分別以各實驗組和對照組的c DNA為模板,采用實時熒光定量PCR檢測P-gp和MRP1 m RNA表達水平。熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。體內(nèi)實驗結果:熒光定量數(shù)據(jù)分析顯示:日本血吸蟲敏感株成蟲暴露于吡喹酮0.5h后,成蟲P-gp表達量是對照組的2.45倍(P0.05);暴露于吡喹酮4h后,成蟲Pgp表達量是對照組的2.50倍(P0.05);暴露于吡喹酮24h后,成蟲P-gp表達量返回到基線水平,與對照組相比無顯著性差異(P0.05)。即體內(nèi)暴露于吡喹酮后,日本血吸蟲成蟲P-gp表達會出現(xiàn)一個短暫性的升高,之后又會返回基線水平。暴露于吡喹酮0.5h后,成蟲MRP1表達量是對照組的1.81倍(P0.05);暴露于吡喹酮4h后,成蟲MRP1表達量與對照組相比仍舊有顯著性升高,是對照組的1.95倍(P0.05);暴露于吡喹酮24h后,成蟲MRP1表達量返回基線水平。即體內(nèi)暴露于吡喹酮后,日本血吸蟲成蟲MRP1表達會出現(xiàn)一個短時間內(nèi)升高,隨后又下降至基線水平的趨勢。結論:日本血吸蟲成蟲在暴露于亞致死劑量吡喹酮后,其體內(nèi)P-gp和MRP1基因表達水平出現(xiàn)短暫性升高,提示日本血吸蟲成蟲體內(nèi)P-gp和MRP1的表達與吡喹酮相關。第三部分日本血吸蟲吡喹酮敏感株和抗性株P-gp和MRP1基因m RNA在不同發(fā)育階段表達水平比較目的:探討日本血吸蟲吡喹酮敏感株與抗性株間P-gp和MRP1基因是否存在表達差異。方法:分別取日本血吸蟲吡喹酮敏感株和抗性株感染釘螺,置于小燒杯中,加入脫氯水在光照下逸尾蚴,以逐級離心法(在50ml離心管6000r/min速度離心3分鐘,沉淀轉(zhuǎn)移至15ml離心管4000r/min速度離心5分鐘,再轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中10000r/min的速度離心3分鐘)收集尾蚴。采用腹部貼片法感染,每只小鼠感染40條尾蚴,建立日本血吸蟲抗性株感染小鼠模型和敏感株感染小鼠模型;尾蚴感染42天后解剖小鼠,采用門靜脈灌注法收集成蟲。取感染小鼠肝臟,剪碎并勻漿過濾,收集濾液,并于錐形瓶中進行沉淀獲得蟲卵;孵化毛蚴并收集入50ml離心管中,以逐級離心法(同尾蚴收集)收集毛蚴。將實驗耗材進行無RNA酶處理后,分別提取日本血吸蟲敏感株和抗性株的成蟲、尾蚴和毛蚴的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。分別以日本血吸蟲敏感株和抗性株的成蟲、尾蚴和毛蚴的c DNA為模板,以實時熒光定量PCR測定P-gp和MRP1 m RNA表達水平。熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。結果:熒光定量PCR熔解曲線顯示3對擴增基因的熔解曲線均呈單一的波峰,曲線重合率均較好,熔解溫度在80℃左右,認為選定的3對引物和熒光定量PCR條件參數(shù)能夠特異性的擴增出內(nèi)參基因片段和目的基因片段。熒光定量數(shù)據(jù)顯示:日本血吸蟲抗性株成蟲、毛蚴、尾蚴P-gp基因m RNA的表達均高于敏感株相應各發(fā)育階段蟲體P-gp基因m RNA的表達。其中抗性株成蟲P-gp的表達量是敏感株的2.21倍(P0.05),抗性株毛蚴是敏感株的3.65倍(P0.05),抗性株尾蚴是敏感株的2.83倍(P0.05);日本血吸蟲抗性株成蟲、毛蚴、尾蚴MRP1基因m RNA的表達均高于敏感株相應各發(fā)育階段蟲體MRP1基因m RNA的表達。其中抗性株成蟲MRP1的表達量是敏感株的5.68倍(P0.05),抗性株毛蚴是敏感株的1.36倍(P0.05),抗性株尾蚴是敏感株的1.50倍(P0.05)。結論:日本血吸蟲吡喹酮敏感株與抗性株間P-gp和MRP1基因表達存在差異,且抗性株成蟲、毛蚴和尾蚴的P-gp和MRP1基因表達均高于敏感株相應的3個發(fā)育階段,提示日本血吸蟲成蟲體內(nèi)P-gp和MRP1的表達增高與吡喹酮抗藥性相關。第四部分P-gp和MRP1抑制劑對日本血吸蟲成蟲排放蟲卵的影響目的:探討P-gp和MRP1抑制劑對日本血吸蟲成蟲排放蟲卵的影響,從而間接了解P-gp和MRP1對日本血吸蟲排放蟲卵的相關性。方法:采用腹部貼片法感染小鼠,建立日本血吸蟲湖南抗性株感染小鼠模型。小鼠感染尾蚴42天后斷頸解剖,采用抗凝生理鹽水灌注法收集成蟲,并挑選沒有損傷、活力良好的日本血吸蟲成蟲置于RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),向體外培養(yǎng)基實驗組中加入不同濃度的Ppg抑制劑R(+)-Verapamil和MRP1抑制劑MK-571。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,培養(yǎng)結束后在倒置顯微鏡下計數(shù)蟲卵量。結果:當R(+)-Verapamil濃度為0.5μM時,對照組成蟲平均排蟲卵量是實驗組的1.6倍;濃度為1μM時,對照組排蟲卵量是實驗組的2.3倍;濃度為2μM時,對照組排蟲卵量是實驗組的3.6倍。當MK-571濃度為5μM時,對照組成蟲平均排蟲卵量是實驗組的1.6倍;濃度為25μM時,對照組排蟲卵量是實驗組的4.3倍;濃度為50μM時,對照組排蟲卵量是實驗組的4.7倍。結論:P-gp抑制劑和MRP1抑制劑均可導致日本血吸蟲成蟲排蟲卵量的減少,并且排蟲卵量與抑制劑濃度呈正相關,提示P-gp和MRP1這兩種轉(zhuǎn)運蛋白可能參與了日本血吸蟲排放蟲卵的生理過程。
【關鍵詞】：日本血吸蟲 吡喹酮 抗藥性 P-gp MRP1 毛蚴 尾蚴 成蟲 實時熒光定量PCR
【學位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R532.21
【目錄】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-22
• 第一部分 日本血吸蟲成蟲P-gp和MRP1基因擴增與鑒定22-34
• 1 材料與試劑22-25
• 2 方法25-29
• 3 結果29-32
• 4 討論32-34
• 第二部分 日本血吸蟲成蟲在吡喹酮刺激下P-gp和MRP1基因mRNA的表達變化34-47
• 一 體外實驗34-41
• 1 材料與試劑34-36
• 2 方法36-38
• 3 結果38-41
• 二 體內(nèi)實驗41-47
• 1 材料與試劑41-42
• 2 方法42-43
• 3 結果43-45
• 4 討論45-47
• 第三部分 日本血吸蟲吡喹酮敏感株和抗性株P-gp和MRP1基因mRNA在不同發(fā)育階段表達水平比較47-64
• 1 材料與試劑47-49
• 2 方法49-53
• 3 結果53-62
• 4 討論62-64
• 第四部分 P-gp和MRP1抑制劑對日本血吸蟲成蟲排放蟲卵的影響64-69
• 1 材料與試劑64-65
• 2 方法65-66
• 3 結果66-68
• 4 討論68-69
• 全文小結69-70
• 不足與展望70-71
• 參考文獻71-75
• 文獻綜述75-79
• 碩士在讀期間發(fā)表論文及參與課題79-80
• 致謝80

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本文編號：741989