本文關(guān)鍵詞：miR-375在乙肝相關(guān)性肝癌的疾病進(jìn)程中的表達(dá)及其臨床意義

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【摘要】：【背景與目的】肝細(xì)胞肝癌(HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,其惡性程度高,病程進(jìn)展快,病死率逐年攀升。在我國乙型肝炎病毒(HBV)的感染是HCC最主要的病因之一。HCC早期癥狀隱匿,中、后期治療效果差,預(yù)后不良。迄今為止,靈敏度或特異度不足是HCC診斷標(biāo)志物存在的普遍問題,雖然近年也有一些新的血清學(xué)標(biāo)志物的研究,但在臨床應(yīng)用上仍有一定的局限性,用于對慢性HBV感染發(fā)展到HBV相關(guān)性肝癌的疾病進(jìn)程進(jìn)行預(yù)測就更難以實(shí)現(xiàn)。因此,急需尋找與HBV慢性感染到癌變過程密切相關(guān)的,有較高特異性和敏感性的血清學(xué)標(biāo)志物,并探討其調(diào)控作用。這將有助于臨床上HCC患者的早期發(fā)現(xiàn)和治療,并對改善肝癌患者的預(yù)后,提高生存率具有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類長度約22nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA小分子,可以對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)miR-375在各種惡性腫瘤中呈低表達(dá),它的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-375對肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲有抑制作用,但缺乏進(jìn)一步的流行病學(xué)現(xiàn)場研究來分析mir-375在健康人群、hbv慢性感染者、肝硬化到hbv相關(guān)性肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)水平;血清中和肝癌組織中mir-375的差異表達(dá)與患者h(yuǎn)bv血清標(biāo)志物、肝癌相關(guān)的臨床檢測指標(biāo)等的相關(guān)性如何也未見報(bào)道。因此,本研究以現(xiàn)場研究和實(shí)驗(yàn)室研究相結(jié)合,檢測從健康人群、慢性乙肝感染、肝硬化發(fā)展到乙肝相關(guān)肝癌進(jìn)程中血清mir-375的差異表達(dá),分析血清和肝癌組織中mir-375表達(dá)水平與疾病進(jìn)展、肝癌臨床檢測指標(biāo)、hbv感染相關(guān)指標(biāo)等的相關(guān)性;同時(shí)在hepg2細(xì)胞平臺上,通過mir-375增強(qiáng)表達(dá)探討其對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。本研究將進(jìn)一步闡明肝癌發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為肝癌的疾病進(jìn)展的預(yù)測提供線索。【方法】1.人群肝癌組織實(shí)驗(yàn)部分:于2014年8月至2015年8月在西京醫(yī)院收集進(jìn)行手術(shù)治療的hbsag陽性hcc患者為研究對象,采集患者肝癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用自行設(shè)計(jì)調(diào)查表收集研究對象人口學(xué)信息和臨床資料,通過qrt-pcr對組織mir-375進(jìn)行檢測,使用elisa法檢測乙肝五項(xiàng)。分析比較肝癌組織與癌旁正常組織mir-375表達(dá)水平的差異,以及肝癌組織mir-375表達(dá)水平與腫瘤分期、大小、數(shù)目、常用腫瘤標(biāo)志物以及hbv血清標(biāo)志物等之間的相關(guān)性。2.人群血清研究部分:2014年10月至2015年2月,在唐都醫(yī)院感染科收集hbv相關(guān)性疾病患者;同期于第四軍醫(yī)大學(xué)校直門診部收集健康對照;并且將第一部分hbv相關(guān)性hcc患者的血清學(xué)標(biāo)本也納入研究。采集血液標(biāo)本,使用統(tǒng)一調(diào)查表收集基本信息和臨床資料,通過qrt-pcr檢測mir-375和hbvdna,使用elisa法檢測乙肝五項(xiàng)。比較健康對照、慢性乙型肝炎無肝硬化患者、肝硬化患者以及hbv相關(guān)性肝癌患者的血清mir-375表達(dá)水平的差異,分析其與患者h(yuǎn)bv血清標(biāo)志物、肝癌臨床檢測指標(biāo)等的相關(guān)性,并繪制roc曲線,分析mir-375對hbv相關(guān)性hcc的診斷效能。3.細(xì)胞研究部分:選擇能夠穩(wěn)定復(fù)制hbv的肝癌細(xì)胞hepg2.2.15和其親本hepg2進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過qrt-pcr檢測兩株肝癌細(xì)胞mir-375表達(dá)水平的差異。利用體外轉(zhuǎn)染mir-375mimic上調(diào)其表達(dá),采用cck-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)分析mir-375的過表達(dá)對hepg2和hepg2.2.15細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用epidata3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫,使用spss19.0分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)、方差分析或mann-whitneyu檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,相關(guān)性使用spearman相關(guān)性分析,p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�！窘Y(jié)果】1.人群肝癌組織實(shí)驗(yàn)部分:納入hbv相關(guān)性hcc研究對象43例,腫瘤數(shù)目平均為1.24±0.58個(gè),腫瘤大小平均為5.99±2.58cm。(1)hbv相關(guān)性肝癌患者肝癌組織中mir-375表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(p0.001)。(2)分析肝癌組織mir-375的表達(dá)與hbv血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性結(jié)果顯示:hbvdna陽性的患者腫瘤組織mir-375的表達(dá)水平顯著低于hbvdna陰性患者(p0.05);抗-hbc陽性患者肝癌組織中mir-375的表達(dá)水平顯著低于抗-hbc陰性患者的水平(p0.001)。(3)肝癌組織mir-375的表達(dá)與hcc患者臨床特征分析結(jié)果顯示:男性患者肝癌組織mir-375的表達(dá)水平顯著低于女性患者(p0.05);存在肝硬化的hcc患者肝癌組織mir-375的表達(dá)水平顯著低于無肝硬化的hcc患者(p0.05);ca19-9出現(xiàn)升高的hcc患者肝癌組織中mir-375的表達(dá)水平顯著低于ca19-9正常的患者(p0.05)。2.人群血清研究部分:納入研究對象177例,其中健康對照40例,慢性乙型肝炎無肝硬化患者20例,hbv肝硬化患者54例,hbv相關(guān)性hcc患者63例。(1)健康人群血清中mir-375的表達(dá)量最高,而慢性乙型肝炎無肝硬化患者、肝硬化患者和hcc患者的血清mir-375水平依次降低。(2)分析血清mir-375的表達(dá)與hbv血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性結(jié)果顯示:血清mir-375在hbeag陽性患者中的表達(dá)水平顯著低于陰性患者(p0.05);抗-hbe陰性患者血清mir-375表達(dá)水平顯著高于抗-hbe陽性的患者(p0.05);血清mir-375在hbvdna陽性患者中的表達(dá)水平顯著低于hbvdna陰性的表達(dá)水平(p0.05)。(3)分析血清mir-375的表達(dá)水平與hbv相關(guān)性患者腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性,結(jié)果顯示:血清mir-375在afp和cea陽性患者中表達(dá)水平均低于陰性患者(p0.05)。(4)繪制roc曲線,結(jié)果顯示:mir-375從全部研究對象中診斷出hbv相關(guān)性hcc患者的靈敏度為73.9%,特異度為93.0%,auc為0.838(95%ci:0.780~0.897);分別使用mir-375和afp從hbv相關(guān)性疾病患者中診斷出hcc患者,前者靈敏度為93.8%,特異度為63.9%,auc為0.768(95%ci:0.644~0.891),后者靈敏度為75.0%,特異度為65.5%,auc為0.584(95%ci:0.456~0.713)。3.細(xì)胞研究部分:(1)與HepG2細(xì)胞相比,mi R-375在表達(dá)HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)(P0.05)。(2)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞miR-375過表達(dá)后的增殖速度小于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞的增殖速度均小于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞。(3)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,未轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)遷移現(xiàn)象;轉(zhuǎn)染后的HepG2.2.15細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,貼壁能力比轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞弱。(4)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-375的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯少于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞;分析轉(zhuǎn)染后的HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞侵襲數(shù)目,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)后,HepG2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目高于HepG2.2.15細(xì)胞�！窘Y(jié)論】1.HBV相關(guān)性HCC患者腫瘤組織中miR-375的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織,腫瘤組織miR-375的表達(dá)水平與抗-HBc以及HBV DNA滴度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。2.健康對照者血清miR-375的表達(dá)水平最高,隨著HBV相關(guān)疾病進(jìn)程的發(fā)展,血清miR-375的表達(dá)水平逐漸降低,在HBV相關(guān)性HCC患者血清中達(dá)到最低水平,這將為肝癌的疾病進(jìn)展的預(yù)測提供重要線索。血清miR-375的表達(dá)水平與HBeAg、抗-HBe、HBV DNA、AFP以及CEA存在相關(guān)性。3.血清miR-375可以作為肝癌的輔助診斷指標(biāo),對HBV相關(guān)性HCC患者的檢出具有較高靈敏度和特異度。4.與HepG2細(xì)胞相比,miR-375在HepG2.2.15細(xì)胞中呈下調(diào)表達(dá)。通過體外miR-375的增強(qiáng)表達(dá),miR-375能夠有效地影響HBV的復(fù)制,并抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,發(fā)揮著類似抑癌基因的作用。
【關(guān)鍵詞】：乙肝病毒 肝細(xì)胞肝癌 微小RNA 臨床意義
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7;R512.62
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-17
• 文獻(xiàn)回顧17-30
• 第一部分miR-375在HBV相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系30-45
• 引言30
• 1 材料30-32
• 2 方法32-35
• 3 結(jié)果35-42
• 4 討論42-45
• 第二部分miR-375在HBV相關(guān)性肝臟疾病患者血清中的表達(dá)水平及與相關(guān)臨床特征的關(guān)系45-59
• 引言45
• 1 材料45-46
• 2 方法46-49
• 3 結(jié)果49-55
• 4 討論55-59
• 第三部分miR-375在肝癌細(xì)胞系的表達(dá)及對其生物學(xué)功能的影響59-73
• 引言59
• 1 材料59-61
• 2 方法61-64
• 3 結(jié)果64-70
• 4 討論70-73
• 小結(jié)73-74
• 參考文獻(xiàn)74-83
• 附錄83-86
• 個(gè)人簡歷和研究成果86-87
• 致謝87

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