本文關(guān)鍵詞：人來(lái)源和蝙蝠來(lái)源乙腦病毒株感染果蝠的初步實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景和目的流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV,簡(jiǎn)稱乙腦病毒)屬于黃病毒科黃病毒屬病毒,首次于1935年在日本從患者腦組織中分離獲得(Nakayama病毒株,簡(jiǎn)稱NAK),故又稱日本腦炎病毒。乙腦病毒為單股正鏈RNA病毒,大小約為11 kb,只含一個(gè)長(zhǎng)的開放閱讀框架(open reading frame, ORF),編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C蛋白、PrM or M蛋白、E蛋白)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5),分五個(gè)基因型(GⅠ、GⅡ、 GⅢ、GIV和GV)。常用的敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是乳鼠,腦內(nèi)接種乙腦病毒后3-4天發(fā)病,一周左右死亡,腦組織內(nèi)含大量感染性病毒,是分離病毒、大量制備抗原的可靠方法。乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(Baby hamster syrian kidney cells,BHK-21)、白紋伊蚊細(xì)胞(A mosquito cells,C6/36)及雞胚成纖維細(xì)胞則是常用的敏感細(xì)胞,病毒在這些細(xì)胞內(nèi)增殖可引起細(xì)胞圓縮、顆粒增多及細(xì)胞脫落等。乙腦病毒所致的疾病為流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis B,JE,簡(jiǎn)稱乙腦),又稱日本腦炎。乙腦流行于熱帶及亞熱帶地區(qū),經(jīng)蚊媒傳播,主要侵犯人及某些動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng),是威脅人群特別是兒童健康的重要人獸共患傳染病,其潛伏期一般在10-14天左右,在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、劇烈頭痛、惡心、嘔吐及意識(shí)障礙等癥狀,重者可出現(xiàn)強(qiáng)直痙攣、驚厥及腦膜刺激征,甚至出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡等。人被帶毒蚊叮咬后,大多數(shù)呈隱性感染,只有少數(shù)人發(fā)病為腦炎,發(fā)病率一般在2/10-10/10萬(wàn)之間,但其病死率達(dá)20%～30%,且30%～50%的幸存者有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因此,乙腦是社會(huì)和家庭的巨大疾病負(fù)擔(dān),是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。乙腦首先于1871年在日本被發(fā)現(xiàn),隨后擴(kuò)展到了印度、巴基斯坦、中國(guó)、澳大利亞、新加坡等國(guó)家和地區(qū),但其主要還是流行于亞洲東南部。我國(guó)是乙腦高發(fā)地區(qū)之一,全國(guó)除了青海以外的省、市均有乙腦病例的報(bào)道,在1957年、1966和1971年曾先后發(fā)生三次乙腦暴發(fā)流行,后兩次發(fā)病人數(shù)分別高達(dá)15萬(wàn)和17萬(wàn)多,發(fā)病率達(dá)20/10萬(wàn)以上。20世紀(jì)80年代以后,隨著對(duì)適齡兒童進(jìn)行乙腦疫苗尤其是減毒活疫苗的接種,我國(guó)乙腦發(fā)病率有了較大幅度的下降,并長(zhǎng)期維持在相對(duì)較低水平,但每年的病例數(shù)仍波動(dòng)于10000例左右,而且局部地區(qū)時(shí)有暴發(fā)流行。野生鳥類和豬是乙腦病毒的主要儲(chǔ)存宿主,豬還是擴(kuò)增宿主,三帶喙庫(kù)蚊是主要的傳播媒介,而人類是乙腦病毒的終宿主。另外,一些其他種類的脊椎動(dòng)物也被證明可以自然感染乙腦病毒,其中包括蝙蝠。迄今為止,已經(jīng)在蝙蝠體內(nèi)檢測(cè)、分離到80多種病毒,例如亨德拉病毒、埃博拉病毒、冠狀病毒、尼帕爾病毒,其中也包括乙腦病毒,所以蝙蝠已被認(rèn)為是多種人畜共患病病毒的重要儲(chǔ)存宿主。中國(guó)和日本的研究均表明在蝙蝠體內(nèi)能檢測(cè)到乙腦病毒和/或乙腦病毒的血清抗體。2008-2009年期間,本課題組亦從廣東、海南及湖南的蝙蝠體內(nèi)分離出4株乙腦病毒(GD1、HN2、YY87和YY158),其中GD1和HN2的全基因組序列已發(fā)表,均屬于GIII型。我們課題組通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)蝙蝠來(lái)源的乙腦病毒株(GD1和HN2)和人來(lái)源的乙腦病毒株(NAK)的核苷酸和氨基酸序列具有高度相似性,但是這些乙腦病毒株對(duì)蝙蝠的感染力(如毒力、免疫性反應(yīng)等)是否存在差異尚不清楚。果蝠以水果為食,體型較大,易于飼養(yǎng),與人類和蚊子關(guān)系密切,且曾有研究表明果蝠可通過(guò)人工注射途徑而實(shí)驗(yàn)感染乙腦病毒。因此,為探討人來(lái)源及蝙蝠來(lái)源乙腦病毒株對(duì)蝙蝠的感染性是否存在差異,我們選擇果蝠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。研究方法1.蝙蝠的捕獲與處理分別于2013年6月和2014年6月,在廣東和海南省部分地區(qū)捕獲果蝠,捕獲蝙蝠的地點(diǎn)主要為廢舊房屋和公園棕櫚樹。懷孕和哺乳期的蝙蝠放生,其余的果蝠則帶回實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)。每天喂養(yǎng)新鮮的水果(香蕉、番石榴、蘋果和梨子等)。2.病毒株在實(shí)驗(yàn)中使用了1株人來(lái)源的乙腦病毒株(NAK)和2株蝙蝠來(lái)源的乙腦病毒株(HN2和GD1)。NAK病毒株為乙腦病毒原型株,于1935年從一個(gè)日本乙腦死亡病人腦組織中分離到,HN2病毒株于2008年分離自海南地區(qū)的長(zhǎng)翼蝠,GD1病毒株于2009年分離自廣東地區(qū)的大足鼠耳蝠。3株乙腦病毒在注射果蝠之前均通過(guò)BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增,并分別計(jì)算其擴(kuò)增后病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose, TCID50)。3.蝙蝠感染乙腦病毒研究中包括了2個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一有8只果蝠,隨機(jī)分成3組(NAK1, HN2-1和GD1-1組),其中NAK1組有3只果蝠(bat1,bat2和bat3),HN2-1組3只果蝠(bat4,bat5和bat6),GD1-1組2只果蝠(bat7和bat8)。三組果蝠分別在大腿根部采取皮下注射的方法注射0.1 ml NAK(10423 BHK-21 TCID50/0.1ml)、HN2(10524 BHK-21 TCID50/0.1ml)和GDI (105.86 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。實(shí)驗(yàn)二有11只果蝠,也隨機(jī)分成3組(NAK2, GD1-2和NEG組),其中NAK2組4只果蝠(bat9, bat 10, bat11和bat12)、GD1-2組5只果蝠(bat13、bat14、bat15、 bat 16和bat17)。這兩組果蝠分別皮下注射0.1 ml NAK (103.50 BHK-21 TCID50/0.1ml)和GD1 (10300 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。NEG組在實(shí)驗(yàn)中作為陰性對(duì)照,包括2只果蝠(bat18和batl9),大腿根部皮下注射0.1 ml不含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液。注射乙腦病毒前后,每天觀察實(shí)驗(yàn)果蝠的臨床表現(xiàn)并記錄。采用割大腿的方式分別獲取果蝠注射乙腦病毒前0天以及注射乙腦病毒后4天、14天、21天的血液。所有果蝠在注射乙腦病毒后21天處死,無(wú)菌解剖觀察果蝠內(nèi)臟變化情況,并取腦組織標(biāo)本,保存在含有RNAlater的凍存管中,放入-80-C保存,待檢。4.蝙蝠乙腦病毒的檢測(cè)單層BHK-21細(xì)胞接種所有實(shí)驗(yàn)果蝠的血清樣本,細(xì)胞染毒血清后,觀察細(xì)胞病變時(shí)間≤7天。采用Roche High Pure viral RNA kit提取蝙蝠腦組織及血清病變細(xì)胞液的病毒RNA,用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,利用TaqMan Real time RT-PCR法檢測(cè)腦組織和血清中的乙腦病毒。5.蝙蝠乙腦病毒抗體的檢測(cè)采用間接ELISA和病毒中和試驗(yàn)兩種方法對(duì)果蝠體內(nèi)的乙腦病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。若ELISA IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性,則進(jìn)一步進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)觀察果蝠乙腦病毒中和抗體產(chǎn)生情況。間接ELISA方法是在商售JEV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步建立的蝙蝠JEV IgG抗體檢測(cè)方法,也就是將購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司的豬JEV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒中的酶標(biāo)二抗,更換為購(gòu)自美國(guó)Thermo公司的Recombinant Protein A/G, Peroxidase Conjugated。病毒中和試驗(yàn)則主要參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS214-2008)操作步驟進(jìn)行。6.病理學(xué)檢查將實(shí)驗(yàn)果蝠腦組織樣本制成病理切片,顯微鏡下觀察果蝠腦組織病理變化情況。7.質(zhì)量控制1)移液槍頭、凍存管、EP管等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性用品；2)RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄所用的容器和配制試劑如移液槍頭、EP管等,均事先用DEPC水處理,且仔細(xì)操作,防止環(huán)境中RNA酶的污染；3)細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作均在細(xì)胞培養(yǎng)間的超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,防止污染；4)果蝠的解剖在無(wú)菌間生物安全柜進(jìn)行,全程做好個(gè)人防護(hù)工作；5)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照；6)果蝠的血清采集和保存過(guò)程嚴(yán)防細(xì)菌污染。結(jié)果1.蝙蝠臨床表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二中的果蝠在注射乙腦病毒前后均未出現(xiàn)任何典型的乙腦臨床癥狀,身上也無(wú)任何受傷的痕跡,毛色正常。果蝠進(jìn)食狀況良好,無(wú)異常表現(xiàn)。在無(wú)菌解剖時(shí),果蝠內(nèi)臟有輕微缺血表現(xiàn)。2.蝙蝠病毒血癥檢測(cè)結(jié)果所有的果蝠血清樣本均通過(guò)BHK-21細(xì)胞進(jìn)行了病毒增值。在實(shí)驗(yàn)一中,細(xì)胞可見到明顯的病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),主要有細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增寬以及細(xì)胞脫落等。實(shí)驗(yàn)一中的大多血清樣本(7/13)通過(guò)TaqMan Real time RT-PCR檢測(cè)乙腦病毒陽(yáng)性,且三個(gè)注射組間檢出率相似。實(shí)驗(yàn)二中的所有果蝠均未檢測(cè)到病毒血癥。3.蝙蝠腦組織乙腦病毒檢測(cè)結(jié)果利用TaqMan Real time RT-PCR法對(duì)實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二中果蝠腦組織標(biāo)本進(jìn)行乙腦病毒檢測(cè),結(jié)果實(shí)驗(yàn)一中所有果蝠腦組織標(biāo)本(除了HN2-1組的bat5)均乙腦病毒檢測(cè)陽(yáng)性,而實(shí)驗(yàn)二中所有果蝠腦組織標(biāo)本均為陰性。4.蝙蝠ELISA檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二的所有注射病毒的果蝠血清均檢測(cè)到了抗乙腦病毒IgG抗體,提示果蝠對(duì)來(lái)自人型和蝙蝠型的乙腦病毒株都可產(chǎn)生免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)一的果蝠在感染乙腦病毒第4天時(shí)乙腦病毒IgG抗體陰性,后全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二的果蝠均在感染乙腦病毒第14～21天左右產(chǎn)生乙腦病毒抗體高峰。5.蝙蝠乙腦病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果對(duì)所有感染乙腦病毒的實(shí)驗(yàn)果蝠的21天血液進(jìn)行病毒中和試驗(yàn),結(jié)果15個(gè)ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中有14個(gè)病毒中和試驗(yàn)陽(yáng)性(陽(yáng)性率93.3%),只有GD1-2組的bat14為陰性。實(shí)驗(yàn)一的中和抗體滴度均高于實(shí)驗(yàn)二的中和抗體滴度(1：23.41～1：56.30 vs.1：5.00～1：15.87,t=-5.733,P0.001)。6.蝙蝠腦組織病理檢查結(jié)果實(shí)驗(yàn)二中NAK2和GD1-2組的果蝠腦組織均大體結(jié)構(gòu)正常,但可見輕微的炎癥反應(yīng),包括輕度的血管充血、水腫、淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)等。實(shí)驗(yàn)一果蝠腦組織未進(jìn)行病理學(xué)檢查�？偨Y(jié)1 果蝠對(duì)人來(lái)源(NAK)及蝙蝠來(lái)源(HN2和GD1)的乙腦病毒株均易感,且均為無(wú)癥狀感染,提示乙腦病毒已經(jīng)適應(yīng)果蝠。2 人來(lái)源(NAK)和蝙蝠來(lái)源(HN2和GD1)乙腦病毒株對(duì)果蝠的感染力、毒力相似,且果蝠對(duì)3株病毒的免疫反應(yīng)性亦相似。3 果蝠感染不同濃度的乙腦病毒后,均可產(chǎn)生血清抗體。而且,中和抗體的滴度與感染濃度存在劑量反應(yīng)關(guān)系。4 實(shí)驗(yàn)一果蝠感染乙腦病毒后,血清和腦組織樣本均檢測(cè)到乙腦病毒,但病毒載量很低,實(shí)驗(yàn)二則未檢測(cè)到病毒,提示乙腦病毒對(duì)蝙蝠的感染力與病毒濃度相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：蝙蝠 乙腦病毒 血清抗體 病毒血癥 實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.32
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第1章 前言18-29
• 1.1 乙腦的流行病學(xué)特征18-20
• 1.2 乙腦病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)20-22
• 1.3 乙腦病毒的致病機(jī)制22
• 1.4 乙腦的診斷、治療和預(yù)防22-23
• 1.5 乙腦疫苗的發(fā)展23-24
• 1.6 乙腦病毒的自然循環(huán)及與蝙蝠的關(guān)系24-26
• 1.7 研究設(shè)想26-29
• 第2章 材料29-33
• 2.1 主要儀器29
• 2.2 主要材料29-30
• 2.3 主要試劑30
• 2.4 主要試劑配制30-33
• 第3章 方法33-49
• 3.1 蝙蝠的捕獲及喂養(yǎng)33-34
• 3.2 病毒株準(zhǔn)備34-36
• 3.3 蝙蝠感染乙腦病毒36-37
• 3.4 蝙蝠血液標(biāo)本的采集及處理37
• 3.5 蝙蝠乙腦病毒的檢測(cè)37-45
• 3.6 蝙蝠乙腦病毒抗體的檢測(cè)45-46
• 3.7 蝙蝠腦組織病理學(xué)觀察46-48
• 3.8 統(tǒng)計(jì)方法48
• 3.9 質(zhì)量控制48-49
• 第4章 結(jié)果49-55
• 4.1 實(shí)驗(yàn)蝙蝠臨床表現(xiàn)49
• 4.2 實(shí)驗(yàn)蝙蝠病毒血癥的檢測(cè)49-51
• 4.3 蝙蝠腦組織乙腦病毒檢測(cè)結(jié)果51
• 4.4 間接ELISA檢測(cè)血清乙腦病毒抗體結(jié)果51-52
• 4.5 病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果52-53
• 4.6 蝙蝠腦組織病理檢查結(jié)果53-55
• 第5章 討論55-59
• 第6章 全文總結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 附錄縮略語(yǔ)詞匯表68-70
• 攻讀學(xué)位期間成果70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 李曉宇,宋宏,付士紅,王環(huán)宇,俞永新,董關(guān)木,陶三菊,陳端,Ichiro Kurane,梁國(guó)棟;中國(guó)流行性乙型腦炎病毒分子生物學(xué)特性研究[J];病毒學(xué)報(bào);2004年03期

2 張彥平;馮子健;CK.Lee;;中國(guó)流行性乙型腦炎防制策略[J];河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

3 SHI ZhengLi;;Emerging infectious diseases associated with bat viruses[J];Science China(Life Sciences);2013年08期

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本文編號(hào)：701469