本文關(guān)鍵詞：人來源和蝙蝠來源乙腦病毒株感染果蝠的初步實驗研究

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【摘要】：研究背景和目的流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV,簡稱乙腦病毒)屬于黃病毒科黃病毒屬病毒,首次于1935年在日本從患者腦組織中分離獲得(Nakayama病毒株,簡稱NAK),故又稱日本腦炎病毒。乙腦病毒為單股正鏈RNA病毒,大小約為11 kb,只含一個長的開放閱讀框架(open reading frame, ORF),編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(C蛋白、PrM or M蛋白、E蛋白)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5),分五個基因型(GⅠ、GⅡ、 GⅢ、GIV和GV)。常用的敏感實驗動物是乳鼠,腦內(nèi)接種乙腦病毒后3-4天發(fā)病,一周左右死亡,腦組織內(nèi)含大量感染性病毒,是分離病毒、大量制備抗原的可靠方法。乳倉鼠腎細胞(Baby hamster syrian kidney cells,BHK-21)、白紋伊蚊細胞(A mosquito cells,C6/36)及雞胚成纖維細胞則是常用的敏感細胞,病毒在這些細胞內(nèi)增殖可引起細胞圓縮、顆粒增多及細胞脫落等。乙腦病毒所致的疾病為流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis B,JE,簡稱乙腦),又稱日本腦炎。乙腦流行于熱帶及亞熱帶地區(qū),經(jīng)蚊媒傳播,主要侵犯人及某些動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng),是威脅人群特別是兒童健康的重要人獸共患傳染病,其潛伏期一般在10-14天左右,在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、劇烈頭痛、惡心、嘔吐及意識障礙等癥狀,重者可出現(xiàn)強直痙攣、驚厥及腦膜刺激征,甚至出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡等。人被帶毒蚊叮咬后,大多數(shù)呈隱性感染,只有少數(shù)人發(fā)病為腦炎,發(fā)病率一般在2/10-10/10萬之間,但其病死率達20%～30%,且30%～50%的幸存者有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因此,乙腦是社會和家庭的巨大疾病負擔,是重要的公共衛(wèi)生問題。乙腦首先于1871年在日本被發(fā)現(xiàn),隨后擴展到了印度、巴基斯坦、中國、澳大利亞、新加坡等國家和地區(qū),但其主要還是流行于亞洲東南部。我國是乙腦高發(fā)地區(qū)之一,全國除了青海以外的省、市均有乙腦病例的報道,在1957年、1966和1971年曾先后發(fā)生三次乙腦暴發(fā)流行,后兩次發(fā)病人數(shù)分別高達15萬和17萬多,發(fā)病率達20/10萬以上。20世紀80年代以后,隨著對適齡兒童進行乙腦疫苗尤其是減毒活疫苗的接種,我國乙腦發(fā)病率有了較大幅度的下降,并長期維持在相對較低水平,但每年的病例數(shù)仍波動于10000例左右,而且局部地區(qū)時有暴發(fā)流行。野生鳥類和豬是乙腦病毒的主要儲存宿主,豬還是擴增宿主,三帶喙庫蚊是主要的傳播媒介,而人類是乙腦病毒的終宿主。另外,一些其他種類的脊椎動物也被證明可以自然感染乙腦病毒,其中包括蝙蝠。迄今為止,已經(jīng)在蝙蝠體內(nèi)檢測、分離到80多種病毒,例如亨德拉病毒、埃博拉病毒、冠狀病毒、尼帕爾病毒,其中也包括乙腦病毒,所以蝙蝠已被認為是多種人畜共患病病毒的重要儲存宿主。中國和日本的研究均表明在蝙蝠體內(nèi)能檢測到乙腦病毒和/或乙腦病毒的血清抗體。2008-2009年期間,本課題組亦從廣東、海南及湖南的蝙蝠體內(nèi)分離出4株乙腦病毒(GD1、HN2、YY87和YY158),其中GD1和HN2的全基因組序列已發(fā)表,均屬于GIII型。我們課題組通過對比發(fā)現(xiàn)蝙蝠來源的乙腦病毒株(GD1和HN2)和人來源的乙腦病毒株(NAK)的核苷酸和氨基酸序列具有高度相似性,但是這些乙腦病毒株對蝙蝠的感染力(如毒力、免疫性反應(yīng)等)是否存在差異尚不清楚。果蝠以水果為食,體型較大,易于飼養(yǎng),與人類和蚊子關(guān)系密切,且曾有研究表明果蝠可通過人工注射途徑而實驗感染乙腦病毒。因此,為探討人來源及蝙蝠來源乙腦病毒株對蝙蝠的感染性是否存在差異,我們選擇果蝠為實驗動物,進行了本實驗。研究方法1.蝙蝠的捕獲與處理分別于2013年6月和2014年6月,在廣東和海南省部分地區(qū)捕獲果蝠,捕獲蝙蝠的地點主要為廢舊房屋和公園棕櫚樹。懷孕和哺乳期的蝙蝠放生,其余的果蝠則帶回實驗室動物房飼養(yǎng)。每天喂養(yǎng)新鮮的水果(香蕉、番石榴、蘋果和梨子等)。2.病毒株在實驗中使用了1株人來源的乙腦病毒株(NAK)和2株蝙蝠來源的乙腦病毒株(HN2和GD1)。NAK病毒株為乙腦病毒原型株,于1935年從一個日本乙腦死亡病人腦組織中分離到,HN2病毒株于2008年分離自海南地區(qū)的長翼蝠,GD1病毒株于2009年分離自廣東地區(qū)的大足鼠耳蝠。3株乙腦病毒在注射果蝠之前均通過BHK-21細胞進行病毒擴增,并分別計算其擴增后病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose, TCID50)。3.蝙蝠感染乙腦病毒研究中包括了2個實驗。實驗一有8只果蝠,隨機分成3組(NAK1, HN2-1和GD1-1組),其中NAK1組有3只果蝠(bat1,bat2和bat3),HN2-1組3只果蝠(bat4,bat5和bat6),GD1-1組2只果蝠(bat7和bat8)。三組果蝠分別在大腿根部采取皮下注射的方法注射0.1 ml NAK(10423 BHK-21 TCID50/0.1ml)、HN2(10524 BHK-21 TCID50/0.1ml)和GDI (105.86 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。實驗二有11只果蝠,也隨機分成3組(NAK2, GD1-2和NEG組),其中NAK2組4只果蝠(bat9, bat 10, bat11和bat12)、GD1-2組5只果蝠(bat13、bat14、bat15、 bat 16和bat17)。這兩組果蝠分別皮下注射0.1 ml NAK (103.50 BHK-21 TCID50/0.1ml)和GD1 (10300 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。NEG組在實驗中作為陰性對照,包括2只果蝠(bat18和batl9),大腿根部皮下注射0.1 ml不含病毒的細胞培養(yǎng)液。注射乙腦病毒前后,每天觀察實驗果蝠的臨床表現(xiàn)并記錄。采用割大腿的方式分別獲取果蝠注射乙腦病毒前0天以及注射乙腦病毒后4天、14天、21天的血液。所有果蝠在注射乙腦病毒后21天處死,無菌解剖觀察果蝠內(nèi)臟變化情況,并取腦組織標本,保存在含有RNAlater的凍存管中,放入-80-C保存,待檢。4.蝙蝠乙腦病毒的檢測單層BHK-21細胞接種所有實驗果蝠的血清樣本,細胞染毒血清后,觀察細胞病變時間≤7天。采用Roche High Pure viral RNA kit提取蝙蝠腦組織及血清病變細胞液的病毒RNA,用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,利用TaqMan Real time RT-PCR法檢測腦組織和血清中的乙腦病毒。5.蝙蝠乙腦病毒抗體的檢測采用間接ELISA和病毒中和試驗兩種方法對果蝠體內(nèi)的乙腦病毒抗體進行檢測。若ELISA IgG抗體檢測陽性,則進一步進行病毒中和試驗觀察果蝠乙腦病毒中和抗體產(chǎn)生情況。間接ELISA方法是在商售JEV ELISA抗體檢測試劑盒的基礎(chǔ)上,進一步建立的蝙蝠JEV IgG抗體檢測方法,也就是將購自武漢科前動物生物制品有限公司的豬JEV ELISA抗體檢測試劑盒中的酶標二抗,更換為購自美國Thermo公司的Recombinant Protein A/G, Peroxidase Conjugated。病毒中和試驗則主要參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準(WS214-2008)操作步驟進行。6.病理學(xué)檢查將實驗果蝠腦組織樣本制成病理切片,顯微鏡下觀察果蝠腦組織病理變化情況。7.質(zhì)量控制1)移液槍頭、凍存管、EP管等實驗耗材均為一次性用品；2)RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄所用的容器和配制試劑如移液槍頭、EP管等,均事先用DEPC水處理,且仔細操作,防止環(huán)境中RNA酶的污染；3)細胞培養(yǎng)的所有操作均在細胞培養(yǎng)間的超凈臺內(nèi)進行,防止污染；4)果蝠的解剖在無菌間生物安全柜進行,全程做好個人防護工作；5)實驗過程嚴格設(shè)立陰、陽性對照及空白對照；6)果蝠的血清采集和保存過程嚴防細菌污染。結(jié)果1.蝙蝠臨床表現(xiàn)實驗一和實驗二中的果蝠在注射乙腦病毒前后均未出現(xiàn)任何典型的乙腦臨床癥狀,身上也無任何受傷的痕跡,毛色正常。果蝠進食狀況良好,無異常表現(xiàn)。在無菌解剖時,果蝠內(nèi)臟有輕微缺血表現(xiàn)。2.蝙蝠病毒血癥檢測結(jié)果所有的果蝠血清樣本均通過BHK-21細胞進行了病毒增值。在實驗一中,細胞可見到明顯的病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),主要有細胞變圓、細胞間隙增寬以及細胞脫落等。實驗一中的大多血清樣本(7/13)通過TaqMan Real time RT-PCR檢測乙腦病毒陽性,且三個注射組間檢出率相似。實驗二中的所有果蝠均未檢測到病毒血癥。3.蝙蝠腦組織乙腦病毒檢測結(jié)果利用TaqMan Real time RT-PCR法對實驗一和實驗二中果蝠腦組織標本進行乙腦病毒檢測,結(jié)果實驗一中所有果蝠腦組織標本(除了HN2-1組的bat5)均乙腦病毒檢測陽性,而實驗二中所有果蝠腦組織標本均為陰性。4.蝙蝠ELISA檢測結(jié)果實驗一和實驗二的所有注射病毒的果蝠血清均檢測到了抗乙腦病毒IgG抗體,提示果蝠對來自人型和蝙蝠型的乙腦病毒株都可產(chǎn)生免疫反應(yīng)。實驗一的果蝠在感染乙腦病毒第4天時乙腦病毒IgG抗體陰性,后全部轉(zhuǎn)為陽性；實驗一和實驗二的果蝠均在感染乙腦病毒第14～21天左右產(chǎn)生乙腦病毒抗體高峰。5.蝙蝠乙腦病毒中和抗體檢測結(jié)果對所有感染乙腦病毒的實驗果蝠的21天血液進行病毒中和試驗,結(jié)果15個ELISA檢測陽性的標本中有14個病毒中和試驗陽性(陽性率93.3%),只有GD1-2組的bat14為陰性。實驗一的中和抗體滴度均高于實驗二的中和抗體滴度(1：23.41～1：56.30 vs.1：5.00～1：15.87,t=-5.733,P0.001)。6.蝙蝠腦組織病理檢查結(jié)果實驗二中NAK2和GD1-2組的果蝠腦組織均大體結(jié)構(gòu)正常,但可見輕微的炎癥反應(yīng),包括輕度的血管充血、水腫、淋巴細胞侵潤等。實驗一果蝠腦組織未進行病理學(xué)檢查。總結(jié)1 果蝠對人來源(NAK)及蝙蝠來源(HN2和GD1)的乙腦病毒株均易感,且均為無癥狀感染,提示乙腦病毒已經(jīng)適應(yīng)果蝠。2 人來源(NAK)和蝙蝠來源(HN2和GD1)乙腦病毒株對果蝠的感染力、毒力相似,且果蝠對3株病毒的免疫反應(yīng)性亦相似。3 果蝠感染不同濃度的乙腦病毒后,均可產(chǎn)生血清抗體。而且,中和抗體的滴度與感染濃度存在劑量反應(yīng)關(guān)系。4 實驗一果蝠感染乙腦病毒后,血清和腦組織樣本均檢測到乙腦病毒,但病毒載量很低,實驗二則未檢測到病毒,提示乙腦病毒對蝙蝠的感染力與病毒濃度相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：蝙蝠 乙腦病毒 血清抗體 病毒血癥 實驗
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.32
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第1章 前言18-29
• 1.1 乙腦的流行病學(xué)特征18-20
• 1.2 乙腦病毒的分子生物學(xué)特點20-22
• 1.3 乙腦病毒的致病機制22
• 1.4 乙腦的診斷、治療和預(yù)防22-23
• 1.5 乙腦疫苗的發(fā)展23-24
• 1.6 乙腦病毒的自然循環(huán)及與蝙蝠的關(guān)系24-26
• 1.7 研究設(shè)想26-29
• 第2章 材料29-33
• 2.1 主要儀器29
• 2.2 主要材料29-30
• 2.3 主要試劑30
• 2.4 主要試劑配制30-33
• 第3章 方法33-49
• 3.1 蝙蝠的捕獲及喂養(yǎng)33-34
• 3.2 病毒株準備34-36
• 3.3 蝙蝠感染乙腦病毒36-37
• 3.4 蝙蝠血液標本的采集及處理37
• 3.5 蝙蝠乙腦病毒的檢測37-45
• 3.6 蝙蝠乙腦病毒抗體的檢測45-46
• 3.7 蝙蝠腦組織病理學(xué)觀察46-48
• 3.8 統(tǒng)計方法48
• 3.9 質(zhì)量控制48-49
• 第4章 結(jié)果49-55
• 4.1 實驗蝙蝠臨床表現(xiàn)49
• 4.2 實驗蝙蝠病毒血癥的檢測49-51
• 4.3 蝙蝠腦組織乙腦病毒檢測結(jié)果51
• 4.4 間接ELISA檢測血清乙腦病毒抗體結(jié)果51-52
• 4.5 病毒中和實驗檢測結(jié)果52-53
• 4.6 蝙蝠腦組織病理檢查結(jié)果53-55
• 第5章 討論55-59
• 第6章 全文總結(jié)59-60
• 參考文獻60-68
• 附錄縮略語詞匯表68-70
• 攻讀學(xué)位期間成果70-71
• 致謝71-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李曉宇,宋宏,付士紅,王環(huán)宇,俞永新,董關(guān)木,陶三菊,陳端,Ichiro Kurane,梁國棟;中國流行性乙型腦炎病毒分子生物學(xué)特性研究[J];病毒學(xué)報;2004年03期

2 張彥平;馮子健;CK.Lee;;中國流行性乙型腦炎防制策略[J];河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

3 SHI ZhengLi;;Emerging infectious diseases associated with bat viruses[J];Science China(Life Sciences);2013年08期

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本文編號：701469