本文關(guān)鍵詞：毒素—抗毒素系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌持留性的相關(guān)研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核分枝桿菌 mazEF基因 relBE基因 同源重組 持留性

【摘要】：目的:本研究擬通過構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失株,初步研究其在不同培養(yǎng)條件下對結(jié)核分枝桿菌生存能力的影響,并對毒素-抗毒素系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌持留性相關(guān)性進(jìn)行初步探討。方法:1.結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失株的構(gòu)建及鑒定。首先以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別從H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和PUC-19K質(zhì)粒上擴(kuò)增出目的基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;然后應(yīng)用融合PCR技術(shù)將目的基因的同源臂和kan基因進(jìn)行雜交拼接,獲得目的融合片段,將該融合片段克隆于p MD-19T(simple)載體形成自殺質(zhì)粒p MD-19T-Δmaz EF-kan和自殺質(zhì)粒p MD-19T-Δrel BE-kan,并將自殺質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中;最后利用電穿孔技術(shù)將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至H37Rv感受態(tài)細(xì)胞中;在卡那霉素抗性改良羅氏培養(yǎng)基上篩選出H37RvΔmaz EF和H37RvΔrel BE缺失突變株單個(gè)菌落,提取陽性菌株全基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增克隆片段并測序,并對所獲得H37RvΔmaz EF和H37RvΔrel BE缺失突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測。2.結(jié)核分枝桿菌H37RvΔMaz EF缺失突變株的生長表型和在不同培養(yǎng)條件下生存能力的初步檢測。分別對野生型和缺失株進(jìn)行抗酸染色,鏡下觀察菌株形態(tài)學(xué)的改變;分別在低氧和營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)缺失株和野生株,并在不同的時(shí)間點(diǎn)對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),比較野生株和缺失株在應(yīng)激條件下,生存能力是否存在差異。3.分別用H37Rv、H37RvΔmaz EF3、H37RvΔmaz EF6和H37RvΔmaz EF9菌株感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,通過CFU計(jì)數(shù)初步檢測結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后細(xì)菌的生存能力;利用流式細(xì)胞儀CELLQest和Win MDl2.9 Version軟件檢測巨噬細(xì)胞感染后的凋亡情況。結(jié)果:經(jīng)傳代15代后,再次測序,未發(fā)生回復(fù)性突變,得到具有遺傳穩(wěn)定性的H37RvΔMaz EF和H37RvΔRel BE基因缺失株�？顾崛旧@示,H37RvΔmaz EF菌株較野生菌株其形態(tài)短小;同時(shí),CFU計(jì)數(shù)結(jié)果顯示缺失菌株生長緩慢。細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞后,缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力低于野生菌株,且H37RvΔmaz EF菌株感染組,巨噬細(xì)胞的凋亡率高于H37Rv菌株感染組。結(jié)論:maz EF毒素-抗毒素系統(tǒng)有助于結(jié)核分枝桿菌在應(yīng)激環(huán)境下的持留生存。研究結(jié)果表明了結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后的持留性及其潛伏感染是多因素相互作用的結(jié)果,確切的感染機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 mazEF基因 relBE基因 同源重組 持留性
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 中文摘要5-6
• 英文摘要6-8
• 英文及字符縮略詞表8-9
• 前言9-11
• 材料11-15
• 1.1 菌種來源11
• 1.2 主要儀器設(shè)備11-12
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑12-13
• 1.4 常用試劑的配制方法13-15
• 方法15-25
• 2.1 結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)maz EF和rel BE缺失株的構(gòu)建及鑒定15-22
• 2.2 結(jié)核分枝桿菌H37RvΔMaz EF缺失突變株生存能力的初步檢測22-23
• 2.3 毒素-抗毒素系統(tǒng)Maz EF基因與結(jié)核分枝桿菌持留性的相關(guān)研究23-24
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 結(jié)果25-35
• 3.1 結(jié)核分枝桿菌H37RvΔMaz EF和H37RvΔRel BE缺失突變株的篩選和鑒定25-30
• 3.2 結(jié)核分枝桿菌H37RvΔMaz EF缺失突變株生存能力的初步研究30-31
• 3.3 毒素-抗毒素系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌持留性的相關(guān)研究31-35
• 討論35-41
• 4.1 結(jié)核病流行及疫情現(xiàn)狀35
• 4.2 結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)35-36
• 4.3 結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)Maz EF36
• 4.4 結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)Rel BE36-37
• 4.5 結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失株的構(gòu)建37-38
• 4.6 結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失株表型及其與生物學(xué)功能初步性分析38-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 文獻(xiàn)綜述47-57
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57-58
• 作者 簡介58-59
• 導(dǎo)師評閱表59

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：681517