本文關(guān)鍵詞：肺結(jié)核病人DNA低甲基化趨勢(shì)與DNA去甲基化酶的相關(guān)性研究

  更多相關(guān)文章： 肺結(jié)核病 DNA甲基化 DNA去甲基化 DNMTs TETs TDG

【摘要】：肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis, PTB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的一種與機(jī)體細(xì)免疫應(yīng)答密切相關(guān)的慢性感染性疾病,在肺結(jié)核病的發(fā)病過(guò)程中,細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體時(shí),抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells,APC)將結(jié)核分枝桿菌抗原通過(guò)抗原-MHC分子復(fù)合物和CD28-CD80雙途徑激活T淋巴細(xì)胞,同時(shí)分泌IL-12、IL-1等細(xì)胞因子,進(jìn)一步刺激免疫細(xì)胞釋放效應(yīng)分子如TNF-a等以殺滅結(jié)核分枝桿菌。DNA甲基化修飾作為動(dòng)植物體內(nèi)一種重要的表觀遺傳修飾形式,參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控,對(duì)腫瘤性疾病、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。而DNA甲基化主要通過(guò)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)上調(diào)DNA甲基化水平；通過(guò)DNA去甲基化酶(TET1、TET2、TET3、TDG)下調(diào)DNA甲基化水平,兩方面的調(diào)節(jié)共同維持DNA甲基化水平的高低。課題組在前期通過(guò)全基因組DNA甲基化芯片研究發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核病患者宿主基因普遍呈低DNA甲基化狀態(tài)。為進(jìn)一步探索肺結(jié)核病人DNA甲基化調(diào)節(jié)的分子機(jī)制、研究肺結(jié)核病人DNA低甲基化狀態(tài)的影響因素,本研究在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,收集健康對(duì)照(γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn),即IGRA陰性)和活動(dòng)性肺結(jié)核病人治療前全血RNA,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法,首先對(duì)參與DNA甲基化下調(diào)的DNA去甲基化酶的4個(gè)基因進(jìn)行定量檢測(cè),以初步明確DNA低甲基化狀態(tài)與DNA去甲基化酶之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在肺結(jié)核病人組中,參與下調(diào)DNA甲基化水平的4個(gè)基因(TET1、TET2、TET3、TDG)表達(dá)均顯著升高(p值0.05)。為了全面探討肺結(jié)核病人DNA低甲基化狀態(tài)的影響因素,我們又對(duì)可以被動(dòng)影響DNA低甲基化狀態(tài)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的3個(gè)基因(DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B)進(jìn)行了定量檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有)NMT1表達(dá)顯著升高(p值0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,我們利用H37Rv裂解抗原以及體外降低DNA甲基化水平的5-氮雜胞嘧啶核苷(5azac)刺激物刺激A549、Beas-2B兩種細(xì)胞系,并收集刺激后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞DNA、RNA。利用甲基化敏感性限制性分析(MSRA)對(duì)所收集DNA樣本進(jìn)行分析,結(jié)果表明,H37Rv抗原、5azac導(dǎo)致DNA甲基化水平降低,且刺激時(shí)間越長(zhǎng)甲基化降低越明顯。我們利用Real-time PCR(RT-PCR)方法對(duì)RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,在兩株細(xì)胞中,DNA去甲基化酶隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的時(shí)間動(dòng)態(tài)圖卻無(wú)明顯特異性表達(dá)。且結(jié)果中在刺激第四天A549細(xì)胞中H37Rv刺激組DNA去甲基化酶TET2、TET3上調(diào),而在Beas-2B中為H37Rv刺激組DNA去甲基化酶TDG上調(diào),即DNA去甲基化酶表達(dá)顯著升高,這與臨床檢測(cè)結(jié)果相符；在A549細(xì)胞H37Rv刺激組有兩種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B上調(diào),而在Beas-2B細(xì)胞H37Rv刺激組中表現(xiàn)為DNMT3A下調(diào)。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是臨床肺結(jié)核病人組還是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)H37Rv刺激組,DNA甲基化水平呈下降趨勢(shì),而DNA去甲基化酶差異性表達(dá)上調(diào)。并且在細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中,隨刺激時(shí)間越長(zhǎng),DNA去甲基化酶表達(dá)逐漸升高,而DNA甲基化降低程度逐漸明顯�？傊�,本研究驗(yàn)證了肺結(jié)核病人DNA甲基化呈現(xiàn)降低趨勢(shì),并初步回答了這種DNA低甲基化趨勢(shì)可能主要受DNA去甲基化酶調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：肺結(jié)核病 DNA甲基化 DNA去甲基化 DNMTs TETs TDG
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R521
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略詞表9-10
• 引言10-21
• 一、肺結(jié)核病面臨新的挑戰(zhàn),宿主免疫應(yīng)答能力與肺結(jié)核病的密切關(guān)聯(lián)是戰(zhàn)勝新挑戰(zhàn)的契機(jī)11-14
• 二、DNA甲基化對(duì)宿主免疫系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)作用14-15
• 三、課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人呈現(xiàn)DNA低甲基化趨勢(shì)15-16
• 四、DNA甲基化水平受DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)控16-21
• 第一部分 活動(dòng)性肺結(jié)核病人及健康人全血RNA中DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量的分析21-30
• 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法21-27
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 三、小結(jié)29-30
• 第二部分 體外刺激A549、Beas-2B細(xì)胞探討DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)DNA低甲基化趨勢(shì)的影響30-43
• 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法30-37
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-42
• 三、小結(jié)42-43
• 討論43-46
• 一、肺結(jié)核病人DNA去甲基化酶影響DNA低甲基化趨勢(shì)的相關(guān)性分析43-44
• 二、肺結(jié)核病人的低甲基化趨勢(shì)可能通過(guò)增強(qiáng)免疫應(yīng)答來(lái)影響疾病的發(fā)生發(fā)展44-45
• 三、DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在同種刺激物刺激過(guò)的不同細(xì)胞中差異表達(dá)的趨勢(shì)及種類(lèi)不同45-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53-56
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表文章56

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