本文關鍵詞：肺結核病人DNA低甲基化趨勢與DNA去甲基化酶的相關性研究

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【摘要】：肺結核病(pulmonary tuberculosis, PTB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的一種與機體細免疫應答密切相關的慢性感染性疾病,在肺結核病的發(fā)病過程中,細胞介導的抗原特異性免疫應答發(fā)揮著重要作用。當結核分枝桿菌感染機體時,抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells,APC)將結核分枝桿菌抗原通過抗原-MHC分子復合物和CD28-CD80雙途徑激活T淋巴細胞,同時分泌IL-12、IL-1等細胞因子,進一步刺激免疫細胞釋放效應分子如TNF-a等以殺滅結核分枝桿菌。DNA甲基化修飾作為動植物體內一種重要的表觀遺傳修飾形式,參與免疫應答反應的調控,對腫瘤性疾病、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。而DNA甲基化主要通過DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases, DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)上調DNA甲基化水平；通過DNA去甲基化酶(TET1、TET2、TET3、TDG)下調DNA甲基化水平,兩方面的調節(jié)共同維持DNA甲基化水平的高低。課題組在前期通過全基因組DNA甲基化芯片研究發(fā)現(xiàn),肺結核病患者宿主基因普遍呈低DNA甲基化狀態(tài)。為進一步探索肺結核病人DNA甲基化調節(jié)的分子機制、研究肺結核病人DNA低甲基化狀態(tài)的影響因素,本研究在前期研究結果的基礎上,收集健康對照(γ干擾素釋放實驗,即IGRA陰性)和活動性肺結核病人治療前全血RNA,通過實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法,首先對參與DNA甲基化下調的DNA去甲基化酶的4個基因進行定量檢測,以初步明確DNA低甲基化狀態(tài)與DNA去甲基化酶之間的關系。結果發(fā)現(xiàn),在肺結核病人組中,參與下調DNA甲基化水平的4個基因(TET1、TET2、TET3、TDG)表達均顯著升高(p值0.05)。為了全面探討肺結核病人DNA低甲基化狀態(tài)的影響因素,我們又對可以被動影響DNA低甲基化狀態(tài)的DNA甲基化轉移酶的3個基因(DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B)進行了定量檢測,結果發(fā)現(xiàn)：只有)NMT1表達顯著升高(p值0.05)。為了進一步驗證,我們利用H37Rv裂解抗原以及體外降低DNA甲基化水平的5-氮雜胞嘧啶核苷(5azac)刺激物刺激A549、Beas-2B兩種細胞系,并收集刺激后不同時間點細胞DNA、RNA。利用甲基化敏感性限制性分析(MSRA)對所收集DNA樣本進行分析,結果表明,H37Rv抗原、5azac導致DNA甲基化水平降低,且刺激時間越長甲基化降低越明顯。我們利用Real-time PCR(RT-PCR)方法對RNA樣本進行檢測。結果顯示,在兩株細胞中,DNA去甲基化酶隨著刺激時間的延長逐漸升高,DNA甲基化轉移酶表達的時間動態(tài)圖卻無明顯特異性表達。且結果中在刺激第四天A549細胞中H37Rv刺激組DNA去甲基化酶TET2、TET3上調,而在Beas-2B中為H37Rv刺激組DNA去甲基化酶TDG上調,即DNA去甲基化酶表達顯著升高,這與臨床檢測結果相符；在A549細胞H37Rv刺激組有兩種DNA甲基化轉移酶DNMT3A、DNMT3B上調,而在Beas-2B細胞H37Rv刺激組中表現(xiàn)為DNMT3A下調。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)無論是臨床肺結核病人組還是體外細胞實驗H37Rv刺激組,DNA甲基化水平呈下降趨勢,而DNA去甲基化酶差異性表達上調。并且在細胞刺激實驗中,隨刺激時間越長,DNA去甲基化酶表達逐漸升高,而DNA甲基化降低程度逐漸明顯�？傊�,本研究驗證了肺結核病人DNA甲基化呈現(xiàn)降低趨勢,并初步回答了這種DNA低甲基化趨勢可能主要受DNA去甲基化酶調控。
【關鍵詞】：肺結核病 DNA甲基化 DNA去甲基化 DNMTs TETs TDG
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R521
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略詞表9-10
• 引言10-21
• 一、肺結核病面臨新的挑戰(zhàn),宿主免疫應答能力與肺結核病的密切關聯(lián)是戰(zhàn)勝新挑戰(zhàn)的契機11-14
• 二、DNA甲基化對宿主免疫系統(tǒng)起著重要調節(jié)作用14-15
• 三、課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)肺結核病人呈現(xiàn)DNA低甲基化趨勢15-16
• 四、DNA甲基化水平受DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉移酶調控16-21
• 第一部分 活動性肺結核病人及健康人全血RNA中DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉移酶表達量的分析21-30
• 一、實驗材料和方法21-27
• 二、實驗結果27-29
• 三、小結29-30
• 第二部分 體外刺激A549、Beas-2B細胞探討DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉移酶對DNA低甲基化趨勢的影響30-43
• 一、實驗材料和方法30-37
• 二、實驗結果37-42
• 三、小結42-43
• 討論43-46
• 一、肺結核病人DNA去甲基化酶影響DNA低甲基化趨勢的相關性分析43-44
• 二、肺結核病人的低甲基化趨勢可能通過增強免疫應答來影響疾病的發(fā)生發(fā)展44-45
• 三、DNA去甲基化酶及DNA甲基化轉移酶在同種刺激物刺激過的不同細胞中差異表達的趨勢及種類不同45-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-53
• 致謝53-56
• 個人簡歷及發(fā)表文章56

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