本文關鍵詞：hMASP-2對結核性肉芽腫形成的影響及機制的研究

  更多相關文章： hMASP-2 BCG 結核性肉芽腫 重組腺病毒 BALB/c小鼠

【摘要】：背景和目的：結核性肉芽腫是結核病的特征性病理改變,結核病的發(fā)生、發(fā)展和預后與結核性肉芽腫的形成、成熟及液化的病理進程密切相關。巨噬細胞募集活化、淋巴細胞浸潤是肉芽腫形成的主要細胞學基礎,細胞因子TNF-α、IFN-γ、 IL-12和CCL2等通過調節(jié)巨噬細胞、淋巴細胞而參與肉芽腫的形成過程。淋巴細胞、巨噬細胞和細胞因子與肉芽腫形成的關系雖然有大量報道,但其機制仍不完全清楚。本實驗通過研究補體系統(tǒng)凝集素途徑關鍵效應酶MASP-2對結核性肉芽腫形成的影響,并揭示其作用機制,為結核病的免疫治療提供一個新型的靶點和思路。方法：采用Invitrogen公司的BLOK-iTTM表達系統(tǒng),用Gateway技術進行體外同源重組,重組質粒轉染HEK293A細胞進行包裝、擴增和構建hMASP-2重組腺病毒。BALB/c小鼠氣管注射結核分枝桿菌(BCG5×107CFU/只)建立肉芽腫模型,實驗分為四組：①rrAd-hMASP-2重組腺病毒干預組(BCG+rAd-hMASP-2組)；②rAd腺病毒載體對照組(BCG+rAd組)；③模型對照組(BCG組)；④正常對照組(PBS組)。腺病毒(5×107PFU/只)滴鼻干預三次,感染21天后處死小鼠進行檢測：①肺組織蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin Staining, HE)染色,光學顯微成像系統(tǒng)采圖,Image-Pro Plus 6.0軟件計算肉芽腫面積,肺組織齊-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色；②肺組織勻漿涂布于7H10固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng),18-20天后進行BCG的菌落計數(shù)；③實時熒光定量PCR(Fluorescence-based Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)檢測hmasp-2、ccl2、 ill2、il8和il6 mRNA相對表達量；④免疫組化(Immunohistochemistry)檢測肺肉芽腫組織C4b沉積、CDllb+細胞數(shù)和CD3+的細胞數(shù)；⑤流式細胞術(Flow Cytometry)檢測肺和脾組織中CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞的數(shù)量及比率；⑥免疫酶聯(lián)吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測肺、脾和血中IFN-γ和TNF-a的水平。⑦高劑量BCG (1×108CFU/只)感染小鼠,觀察rAd-hMASP-2對BCG感染小鼠生存率的影響。結果：1.經(jīng)PCR和測序驗證重組腺病毒rAd-hMASP-2包裝成功,并在HEK293A細胞中進行擴增,滴度為109-1010PFU/ml。2.氣管注射BCG (5×107CFU/只)感染BALB/c小鼠,第21天在肺部形成典型的結核性肉芽腫病變,建立了BCG感染結核性肉芽腫的小鼠模型。3.與三個對照組相比,BCG+rAd-hMASP-2組檢測到hmasp-2 mRNA的表達；并且與BCG+rAd組(光密度值為0.0022±0.0013)相比,BCG+rAd-hMASP-2組肺組織C4b沉積(光密度值為0.0252±0.0129)的面積明顯增高(P=0.003),hMASP-2在小鼠肺組織表達并活化裂解C4。4.BCG+rAd-hMASP-2組小鼠生存率為80%,明顯高于BCG+rAd組(生存率為50%),hMASP-2能夠大大降低BCG感染小鼠的死亡率。5.與BCG+rAd組相比,BCG+rAd-hMASP-2組肺組織肉芽腫面積百分比(30.2%±17.4%)明顯增大(P=0.023)；且BCG+rAd-hMASP-2組小鼠肺部荷菌量(3.3×105+4.5×105 CFU/g)顯著減低(P=0.005),hMASP-2促進肉芽腫形成減低小鼠肺部載菌量。6.與BCG+rAd組比較,BCG+rAd-hMASP-2組小鼠肺組織淋巴細胞總數(shù)(2.56×105±6.41×104個)明顯增多(P=0.038)、CD34T細胞數(shù)(1.94×104±1.93×103個)顯著升高(P=0.037)、CD3+CD8+T細胞數(shù)(2.64×103±1.08×103個)明顯升高(P=0.042)、且BCG+rAd-hMASP-2組CD3+細胞數(shù)(光密度值為0.063±0.0065)和CDllb+細胞數(shù)(光密度值為0.0124±0.0032)顯著增高,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),hMASP-2促進小鼠肺組織T細胞聚集。7.與BCG+rAd組比較,BCG+rAd-hMASP-2組血清中TNF-α(21.9pg/ml)的含量明顯增高(P0.05)；與BCG組相比,肺組織中TNF-α(521.2pg/ml)的含量明顯增高(P0.05)。肺組織中IFN-γ(158.1 pg/ml)的含量明顯高于PBS對照組(P0.05),hMASP-2很可能促進肺組織免疫細胞分泌TNF-α和IFN-γ。8.與BCG+rAd組相比,BCG+rAd-hMASP-2組il6 mRNA的表達量(1.21)、il12mRNA的表達量(1.86)和c cl2 mRNA的表達(2.07)均上調,而il8 mRNA的表達量(0.57)下調。iMASP-2促進機體分泌IL-6、IL-12和CCL2等細胞因子。結論：1.BALB/c、鼠氣管注射5×107 CFU BCG可建立結核性肉芽腫的動物模型。2.重組腺病毒rAd-hMASP-2能夠在BCG感染小鼠肺組織表達和活化hMASP-2并裂解補體C4,啟動凝集素途徑。3hMASP-2能促進BCG感染小鼠肺部肉芽腫的形成、降低BCG感染小鼠肺部荷菌量、提高BCG感染小鼠的生存率。4.MASP-2能夠增加肺組織中CD11b+巨噬細胞的數(shù)量和促進CCL2、IL-6和IL-12等細胞因子的表達和分泌。表明lMASP-2通過上調趨化因子CCL2,趨化和激活CD11b+巨噬細胞,誘導其分泌TNF-α、IL-6和IL-12等細胞因子,進而促進肺組織肉芽腫的形成、減低肺組織荷菌量、提高小鼠BCG感染生存率。5. hMASP-2能夠增加肺組織中CD3+T細胞的數(shù)量和促進IFN-γ的分泌,尤其使肺組織中CD3+ CD8+ T細胞亞群數(shù)量顯著增加,表明hMASP-2能夠促進肺組織CD3+CD8+T細胞聚集和活化。在巨噬細胞分泌IL-12參與下,誘導Thl細胞和CTL細胞的免疫應答及促進分泌IFN-γ等細胞因子,進而參與肺組織肉芽腫的形成,增強機體對結核分枝桿菌感染靶細胞的殺傷、減低肺組織荷菌量、提高小鼠BCG感染生存率。
【關鍵詞】：hMASP-2 BCG 結核性肉芽腫 重組腺病毒 BALB/c小鼠
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 前言13-20
• 1. 結核病的免疫病理機制13-14
• 2. 結核病治療的現(xiàn)狀和存在的困難14-16
• 3. MASP-2的結構和功能16-19
• 4. 實驗技術路線19-20
• 第一章 rAd-hMASP-2的構建20-32
• 1.1 材料與方法20-25
• 1.1.1 主要儀器設備20
• 1.1.2 主要試劑用品20-21
• 1.1.3 方法21-25
• 1.2 結果25-30
• 1.2.1 hMASP-2目的基因的PCR擴增25
• 1.2.2 pYr-ads-4-hMASP-2質粒的雙酶切鑒定25-26
• 1.2.3 pYr-ads-4-MASP-2質粒的測序驗證26-28
• 1.2.4 pAd-4-hMASP2的XbaI單酶切鑒定28
• 1.2.5 pAd-4-hMASP2質粒測序驗證28
• 1.2.6 重組腺病毒的PCR驗證28-29
• 1.2.7 rAd-hMASP2的擴增和滴度的檢測29-30
• 1.3 討論30-31
• 1.4 小結31-32
• 第二章 BCG感染結核性肉芽腫形成小鼠模型的建立32-42
• 2.1 材料與方法32-37
• 2.1.1 主要儀器和設備32
• 2.1.2 主要試劑用品32
• 2.1.3 方法32-37
• 2.2 結果37-40
• 2.2.1 BCG擴增培養(yǎng)后濃度測定37
• 2.2.2 不同時間點各組小鼠肺組織荷菌量比較37-38
• 2.2.3 不同時間點小鼠肺組織肉芽腫面積變化38
• 2.2.4 第3周各組小鼠肺組織荷菌量比較38-39
• 2.2.5 第3周各組小鼠肺組織病理和肉芽腫面積比較39-40
• 2.3 討論40-41
• 2.4 小結41-42
• 第三章 hMASP-2在小鼠體內表達及其活性的檢測42-49
• 3.1 材料與方法42-46
• 3.1.1 主要儀器設備42
• 3.1.2 主要試劑用品42
• 3.1.3 方法42-46
• 3.2 結果46-48
• 3.2.1 hMASP-2在小鼠肺組織的表達46
• 3.2.2 hMASP-2的裂解C4活性檢測46-48
• 3.3 討論48
• 3.4 小結48-49
• 第四章 hMASP-2對結核性肉芽腫小鼠生存率的影響49-53
• 4.1 材料與方法49-50
• 4.1.1 實驗動物49
• 4.1.2 菌株49
• 4.1.3 其他49
• 4.1.4 方法49-50
• 4.2 結果50-51
• 4.3 討論51-52
• 4.4 小結52-53
• 第五章 hMASP-2對結核性肉芽腫病理損傷的影響53-61
• 5.1 材料與方法53-55
• 5.1.1 主要儀器設備53
• 5.1.2 主要試劑用品53
• 5.1.3 方法53-55
• 5.2 結果55-59
• 5.2.1 小鼠肺組織肉眼形態(tài)55-56
• 5.2.2 小鼠肺組織的病理變化56-58
• 5.2.3 小鼠肺組織細菌載量比較58-59
• 5.3 討論59-60
• 5.4 小結60-61
• 第六章 hMASP-2對小鼠肺結核肉芽組織巨噬細胞的影響61-72
• 6.1 材料與方法61-64
• 6.1.1 主要設備儀器61
• 6.1.2 主要試劑用品61
• 6.1.3 方法61-64
• 6.2 結果64-69
• 6.2.1 免疫組化檢測CD11b~+巨噬細胞64-66
• 6.2.2 ELISA檢測TNF-α分泌水平66-67
• 6.2.3 RT-qPCR檢測小鼠ccl2、il6、il8和il12 mRNA的相對表達量67-69
• 6.3 討論69-71
• 6.4 小結71-72
• 第七章 hMASP-2對小鼠肺結核肉芽腫組織T細胞的影響72-86
• 7.1 材料與方法72-76
• 7.1.1 主要儀器和設備72
• 7.1.2 主要試劑用品72
• 7.1.3 方法72-76
• 7.2 結果76-84
• 7.2.1 免疫組化檢測CD3~+T細胞76-77
• 7.2.2 流式細胞儀檢測T細胞及亞群的數(shù)量和百分比77-83
• 7.2.3 ELISA檢測IFN-γ的水平83-84
• 7.3 討論84-85
• 7.4 小結85-86
• 結論86-87
• 總結與展望87-89
• 參考文獻89-98
• 在學期間的研究成果98-99
• 縮略語表99-101
• 致謝101

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本文編號：574082