本文關(guān)鍵詞：我國部分地區(qū)HIV-1流行及進化動力學(xué)研究

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【摘要】：1989年HIV從緬甸進入云南省靜脈吸毒人群(IDUs),之后隨著HIV在我國的第一次、第二次爆發(fā)流行,HIV向全國傳播。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)報告,截止2011年底我國現(xiàn)有存活HIV感染者/AIDS病人共計78萬人,全人群感染率0.058%。全國31個省、自治區(qū)、直轄市,93%的縣、區(qū)報告當(dāng)?shù)赜蠬IV感染者/AIDS病人。伴隨著HIV感染者/AIDS病人的活動HIV傳遍全國,而不同的活動方式產(chǎn)生了不同的感染人群。我國HIV感染人群可以分為異性性傳播人群、男男同性戀人群(MSM)、IDU人群、經(jīng)血傳播人群、母嬰傳播人群。在我國HIV流行早期以IDU人群、經(jīng)血傳播人群為主,其中經(jīng)血傳播人群主要為有償獻血者。隨著國家對HIV防治宣傳力度增大,上述兩個人群感染HIV比例逐年減少,而性傳播成為HIV感染的主要途徑。2011年,性傳播人群所占全國HIV感染者/AIDS病人比例為75%,其中MSM人群占13%。性傳播人群構(gòu)成復(fù)雜,包括異性性傳播人群和MSM人群,人群的年齡跨度大、學(xué)歷跨度大、婚姻情況差異大。多樣化的人群特點導(dǎo)致性傳播人群中HIV-1毒株基因型呈現(xiàn)復(fù)雜的多樣性。全國所有HIV-1毒株,包括Thai B亞型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF55_01B、CRF65_cpx等在性傳播人群中皆有發(fā)現(xiàn),而且在性傳播人群中重組產(chǎn)生多種獨特重組型(URF)毒株。北京作為我國首都、國際化大都市擁有數(shù)量龐大的MSM群體;河北地處北京與河南之間,早年受到河南有償獻血人群影響HIV從南部傳入,近年來當(dāng)?shù)豈SM人群與北京MSM人群之間聯(lián)系緊密;深圳毗鄰香港,是我國最早的經(jīng)濟特區(qū),流動人口數(shù)量龐大,2012年發(fā)現(xiàn)的新型流行重組毒株CRF55_01B的起源地。本研究利用源自上述3個地區(qū)HIV感染者/艾滋病病患者的血漿標(biāo)本及其產(chǎn)出的病毒基因序列,采用多種生物信息學(xué)分析方法,研究這三個地區(qū)HIV-1毒株的流行和進化特征,并建立新型重組毒株的感染性克隆,以期闡明我國不同類型地區(qū)HIV進化特點和流行情況,并為致病機制研究奠定基礎(chǔ)。第一部分北京MSM人群HIV流行動力學(xué)研究有研究表明,北京MSM人群中HIV-1的感染率在2002年、2006年、2010年分別為:3.1%、4.8%、6%,這一數(shù)據(jù)明顯高于同期的其他城市和地區(qū)。近年來,針對HIV-1在北京MSM人群中流行特征的研究越來越多,但大多是血清學(xué)或者一些初步的分子流行病學(xué)研究。本研究旨在分析北京MSM人群中流行的HIV-1毒株的流行動力學(xué)以及進化特征。整理本實驗室從北京市MSM人群HIV感染者的血漿標(biāo)本中獲得的HIV基因序列,自Los Alamos HIV sequence database中下載我國的具有時間、傳播途徑、地域信息的基因序列,共收集HIV-1 gag基因906位至1446位(540 bp)的基因序列778條,通過最大似然法、Bayesian coalescent理論以及Bayesian Birth-Death理論重建北京MSM人群中流行的HIV-1毒株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹、估算突變速率、推斷共同祖先株時間(t MRCA)、重建群體動態(tài)參數(shù)、計算隨著時間變化的有效再生數(shù)(R0),分析北京MSM人群與其他人群HIV流行的關(guān)系,推斷進化和流行特征。目的是闡明北京MSM人群中流行的HIV-1不同亞型毒株之間的關(guān)系、了解HIV-1在該人群中的動態(tài)變化過程,為北京地區(qū)MSM人群的行為干預(yù)提供切入點,為HIV-1的防控提供基礎(chǔ)信息。結(jié)果:(1)北京MSM人群中流行的HIV-1毒株包括B、CRF01_AE和CRF07_BC。(2)在全國HIV毒株的ML進化樹中,有3個北京MSM簇(系統(tǒng)發(fā)育樹中分支節(jié)點SH值≥90%,序列數(shù)量≥40條定義為簇;如果簇中北京MSM人群的序列數(shù)最多則定義為北京MSM簇),即B-1簇、01_AE-1簇、01_AE-2簇,MSM人群序列所占的比例分別為72%、64%和41%。在01_AE-1簇內(nèi)有一個本地簇(01_AE-1-2),其中北京MSM所占的比例(63%)顯著高于01_AE-2簇(P=0.002,χ2=9.2972)。(3)B-1簇毒株是經(jīng)過至少3次傳入事件進入北京MSM人群的,傳入時間是1991年3月(1984年7月~1997年2月)、1994年1月(1990年5月~1999年3月)和1994年12月(1989年5月~1998年4月)。CRF01_AE毒株進入北京MSM人群是經(jīng)過兩次傳入事件,發(fā)生時間01_AE-1簇為2000年11月(1999年6月~2002年2月)、01_AE-2簇為2000年6月(1999年4月~2001年6月);值得注意的是在2003年5月(2002年9月~2004年1月)01_AE-1簇內(nèi)形成一個穩(wěn)定的本地簇01_AE-1-2簇。(4)01_AE-1簇突變速率高于其他兩簇,流行特征重塑分析顯示,01_AE-1簇增長持續(xù)至2008年,01_AE-1-2簇增長持續(xù)至2007年,01_AE-2簇從2003年開始增長持續(xù)至2006年。3簇R值(effective reproductive number)在2008年左右后小于1,但是刪除01_AE-1-2簇中異性性傳播人群序列后R值在2010年出現(xiàn)回升。結(jié)論:北京MSM人群中存在多種HIV亞型毒株流行,雖然B亞型毒株傳入時間最早,但近年來傳播趨勢趨于平穩(wěn);CRF01_AE毒株傳入時間雖然較晚,但增長迅速,對HIV在北京地區(qū)的流行具有明顯的推動作用。因此對CRF01_AE毒株的防控,對MSM人群采取行之有效的干預(yù)措施將有助于減少該地區(qū)HIV的流行。第二部分河北省不同高危人群中HIV流行毒株的關(guān)系分析河北環(huán)抱北京、天津,毗鄰河南。2011年,北京、天津MSM人群HIV感染率為6%左右;河南1994-1998年在既往有償獻血人群中爆發(fā)HIV感染,該人群的感染率高達(dá)15.54%。受北京、天津MSM人群影響,河北某些城市MSM人群HIV感染率達(dá)已經(jīng)到4.8%。而靠近河南的南部地區(qū),有償獻血人群中HIV感染一度形勢嚴(yán)峻。據(jù)河北CDC提供的數(shù)據(jù)顯示,2005年河北新報告HIV感染者/AIDS病人244例,2010年為431例,2013年為1023例。HIV已經(jīng)在河北各高危人群間傳播,剖析各個流行毒株與不同高危人群之間的關(guān)系有助于調(diào)整該地區(qū)行為干預(yù)策略以及疫苗研發(fā)策略。在本研究中我們利用從河北不同高危人群中獲得的106份HIV-1陽性血漿標(biāo)本,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增獲得96份標(biāo)本的gag、pol全長基因片段并測序,使用phyml 3.0等軟件分析病毒在不同人群中的特征以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,以期了解不同高危人群之間傳播關(guān)系。結(jié)果:(1)對亞型分析結(jié)果顯示B亞型為河北最主要的流行毒株(52.08%),之后依次是CRF01_AE(34.4%)、CRF07_BC(6.3%)、C亞型(4.2%)、CRF02_AG(1.0%)、CRF08_BC(1.0%)以及URF(1.0%)。異性性傳播包含所有發(fā)現(xiàn)的亞型,不同人群中亞型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確檢驗p0.001)。(2)進化關(guān)系分析顯示河北HIV-1毒株可以分為6簇,分別為:2個B亞型簇,2個CRF01_AE簇,1個CRF07_BC簇和1個C亞型簇,說明河北的HIV-1流行是多次輸入導(dǎo)致。河北異性性傳播人群分散在各個高危人群之中,自身不獨立成簇;各高危人群在進化樹中與國內(nèi)其他地區(qū)相同感染途徑人群聯(lián)系緊密。結(jié)論:河北發(fā)現(xiàn)多種HIV基因型毒株,HIV的流行呈多樣性。異性性傳播與其他高危人群聯(lián)系緊密,HIV從高危人群向普通人群擴散。河北HIV毒株的遺傳特征將有助于了解我國的HIV分布及進化特點,同時為我國HIV疫苗設(shè)計提供序列信息。第三部分深圳市性傳播人群中HIV-1流行毒株的多樣性研究深圳自1992年發(fā)現(xiàn)HIV-1感染者,截止2013年,確診超過7000例HIV感染者/AIDS患者,2013年的新發(fā)感染高出2012年19.2%。深圳主要HIV流行毒株為B亞型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B、CRF08_BC。異性性傳播人群和MSM人群是深圳HIV主要流行人群。2012年在深圳MSM人群中發(fā)現(xiàn)新型重組毒株CRF55_01B后,又在北京、安徽、遼寧等地發(fā)現(xiàn)該毒株,其以CRF01_AE為骨架與B亞型在深圳MSM人群中重組產(chǎn)生。本研究旨在通過對深圳不同人群中流行的HIV毒株分析,了解深圳現(xiàn)在HIV毒株在人群中的分布特點以及深圳HIV毒株的進化特征。本研究在2013年采集深圳市HIV-1陽性血漿標(biāo)本250份,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增測序獲得198份標(biāo)本的gag/pol全長基因序列,利用gag與pol全長基因使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析毒株進化特征;使用RIP、genotyping tool、jp HMM-HIV等工具分析URF毒株基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果:(1)本次研究的深圳HIV感染者以男性為主(87.37%),平均年齡33歲,以異性性傳播人群、MSM人群為主。與異性性傳播人群相比,MSM人群的平均年齡低(32.5歲)、未婚比例高(81.58%)、學(xué)歷層次高。(2)亞型分析結(jié)果顯示CRF01_AE與CRF07_BC占總體的69.7%,其次是由深圳起源的CRF55_01B 26例(13.13%),其他亞型毒株包括B亞型、D亞型、CRF08_BC、CRF59_01B以及在性傳播途徑中發(fā)現(xiàn)的13例URF(6.57%),13例URF毒株有9例是由CRF01_AE、B亞型、C亞型重組而成。異性性傳播人群中包含所有流行亞型以及5例URF。(3)進化關(guān)系分析顯示,深圳MSM人群中CRF01_AE、B亞型毒株系由北京地區(qū)傳入,而后形成人群內(nèi)部流行。CRF07_BC毒株中深圳本地MSM人群和本地異性性傳播人群關(guān)系緊密,不能證明深圳MSM人群與北京MSM人群有直接聯(lián)系;深圳異性性傳播人群與北京地區(qū)MSM人群聯(lián)系緊密。CRF55_01B中MSM人群與異性性傳播人群聯(lián)系緊密,該毒株已經(jīng)在深圳異性性傳播中流行。在CRF01_AE、CRF08_BC中各有一簇由異性性傳播人群組成,比較這兩簇中異性性傳播人群與MSM人群為主的傳播簇中異性性傳播人群的學(xué)歷,發(fā)現(xiàn)MSM人群為主的傳播簇中異性性傳播人群普遍年輕、學(xué)歷較高、未婚。結(jié)論:深圳HIV-1毒株基因型具有豐富的多樣性,包含中國所有主要流行毒株以及深圳起源的CRF55_01B。性傳播人群中豐富的HIV-1基因型使得深圳出現(xiàn)較高比例URF毒株,基因結(jié)構(gòu)相似的兩例URF出現(xiàn)提示該毒株可能已經(jīng)發(fā)生傳播,對于新型重組毒株的發(fā)生和流行應(yīng)該予以高度警惕。MSM人群中HIV-1毒株已經(jīng)向異性性傳播人群擴散,CRF07_BC毒株、CRF55_01B毒株中MSM人群與異性性傳播人群聯(lián)系緊密,深圳性傳播人群HIV-1防控形勢極為嚴(yán)峻。異性傳播簇中異性傳播人群與MSM簇中的異性性傳播人群可能屬于不同的社會階層,這個群體可能主要為文化水平低、經(jīng)濟收入低、主要從事體力勞動、活動范圍有限的人群,很可能通過低端異性性服務(wù)感染。第四部分構(gòu)建深圳流行HIV-1毒株的全長基因克隆HIV具有高變異性,在研究HIV毒株的致病性、耐藥、疫苗中不同亞型之間差異明顯。截止到目前,全球所流行的HIV-1毒株除A-D、F-H、J、K亞型外,還有72種流行重組毒株,超過20%的HIV感染者/AIDS病人感染流行重組毒株�，F(xiàn)在使用最普遍的感染性克隆是歐美B亞型克隆p NL4-3,歐美B亞型在中國早期流行是主要流行毒株。近年來隨著性傳播人群的快速增長歐美B亞型在HIV感染者/AIDS病人中所占的比例越來越低,即使是與歐美B亞型同源的Thai B亞型在中國流行HIV-1毒株中所占的比例也顯著低于CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC。p NL4-3克隆已經(jīng)不能滿足中國HIV-1毒株研究的需要,對于各個流行亞型HIV-1毒株甚至是URF毒株的感染性克隆需求越來越迫切。然而,比較遺憾的是目前感染性克隆構(gòu)建的方法還不能普及,獲得不同亞型毒株感染性克隆的難度還是很大。我們從3例深圳HIV感染者/AIDS病人的血液樣本中提取純化基因組DNA,擴增獲得HIV-1兩個半分子序列,然后分別進行T載體連接構(gòu)建質(zhì)粒,再使用xho I和Aar I限制性內(nèi)切酶對兩個半分子質(zhì)粒進行酶切,獲得兩個目的條帶后利用T4連接酶連接,最后轉(zhuǎn)化包裝成為全長質(zhì)粒。將對全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,ELISA法測定培養(yǎng)上清液中的HIV-1 P24抗原,監(jiān)測病毒復(fù)制。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建3個全長克隆(S7 9745bp、S13 9720 bp、S15 9709 bp),S7基因型為CRF55_01B,S13是URF毒株由CRF01_AE和B亞型重組而成,S15也是URF毒株由CRF01_AE、B亞型和C亞型重組而成。(2)S7、S13、S15都是以CRF01_AE為骨架在2953位至3340位插入B亞型片段,雖然在3732位也都插入B亞型片段,但是S7插入的長度要大于S13和15,而S13和S15插入的B片段長度一致。同時S15在1177位至2005位、4345位至4792位插入C亞型片段。(3)對S13和S15的基因片段來源進行分析,S13、S15中B亞型片段全部來自于CRF55_01B,S15中C亞型片段來自于CRF07_BC,而骨架CRF01_AE可能是由CRF55_01B重組而來。(4)經(jīng)多次轉(zhuǎn)染均未獲得具有感染性的包裝病毒。結(jié)論:獲得3株深圳HIV-1毒株的全基因組克隆,由CRF01_AE與B亞型及CRF01_AE、B亞型、C亞型片段重組產(chǎn)生的URF毒株中B亞型片段可能來自CRF55_01B毒株,C亞型片段可能來自于CRF07_BC毒株,而CRF01_AE片段也有可能來自于CRF55_01B毒株。全長克隆方法的構(gòu)建為進一步構(gòu)建感染性克隆奠定了基礎(chǔ),也為深圳HIV-1毒株致病性的研究創(chuàng)造了條件。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 性傳播 基因亞型 系統(tǒng)發(fā)育 全長克隆
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-22
• 第一部分 北京MSM人群HIV流行動力學(xué)研究22-43
• 材料和方法23-25
• 結(jié)果25-41
• 1. 序列收集和分析數(shù)據(jù)系列的建立25-26
• 2. 北京MSM人群HIV進化關(guān)系分析26-33
• 3. 北京MSM人群HIV進化特征分析33-35
• 4. 北京MSM人群HIV流行特征分析35-41
• 討論41-42
• 結(jié)論42-43
• 第二部分 河北省不同高危人群中HIV流行毒株的關(guān)系分析43-57
• 材料和方法43-49
• 結(jié)果49-55
• 1. 河北HIV-1 亞型分布49-53
• 2. 不同高危人群中流行HIV-1 毒株系統(tǒng)發(fā)育分析53-55
• 討論55-56
• 結(jié)論56-57
• 第三部分 深圳市性傳播人群中HIV-1 流行毒株的多樣性研究57-78
• 材料和方法58-60
• 結(jié)果60-75
• 1. 序列獲取以及數(shù)據(jù)集建立60-63
• 2. 深圳HIV-1 亞型分布分析63-70
• 3. 深圳HIV-1 毒株進化關(guān)系分析70-75
• 討論75-77
• 結(jié)論77-78
• 第四部分構(gòu)建深圳流行HIV-1 毒株的全長基因克隆78-91
• 材料和方法78-85
• 結(jié)果85-90
• 討論90
• 結(jié)論90-91
• 參考文獻91-98
• 綜述 系統(tǒng)發(fā)育和貝葉斯理論推斷HIV進化及流行98-107
• 參考文獻103-107
• 碩士期間發(fā)表論文107-108
• 個人簡歷108-109
• 致謝109

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本文編號：542572