本文關鍵詞：細胞自噬及代謝相關因素在HIV-1 Tat激活中的作用機制研究

  更多相關文章： Tat 自噬 M2型丙酮酸激酶 腺苷酸活化蛋白激酶 丹參酮II A

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(HIV-1)是引起獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)錄激活因子Tat蛋白由HIV-1 tat基因編碼,可以反式激活HIV-1的長末端重復序列,在調(diào)控HIV-1基因的表達以及生命周期的過程中有重要作用,已經(jīng)成為抗HIV-1治療中的一個新的潛在靶點。目前,研究發(fā)現(xiàn)自噬及細胞代謝狀態(tài)在病毒感染過程中有重要作用。本課題主要研究自噬及代謝相關因素在HIV-1 Tat反式激活中的作用及分子機制。丹參酮II A是從傳統(tǒng)中藥丹參中提煉而來的,它在包括抗腫瘤,抗氧化,抗病毒及抗突變等多種生命活動中發(fā)揮重要作用。本課題還探索了傳統(tǒng)中藥中的有效成分丹參酮II A對代謝的影響,及其對HIV-1 Tat反式激活的影響和涉及的信號通路。實驗結果表明,HIV-1 Tat可以通過提高蛋白激酶B(Akt)及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平來激活Akt/mTOR通路,從而抑制自噬相關蛋白ATG7,ATG 5及Beclin 1的表達,PI3K(磷脂酰肌醇3羥激酶)/Akt/mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以逆轉(zhuǎn)此過程。同時,代謝相關因素M2型丙酮酸激酶(PKM2)及單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)可以通過作用于Akt/mTOR通路改變細胞自噬的程度:PKM2表達的降低以及AMPK激活劑AICAR引起的AMPK的活化可以下調(diào)Akt和/或mTOR的磷酸化,抑制Akt/mTOR通路,促進自噬相關蛋白ATG 7,ATG 5及Beclin 1的表達,而AMPK的敲除則在上述過程中發(fā)揮相反的作用。雷帕霉素,3-甲基腺嘌呤,PKM2的敲除及AMPK的活化會抑制HIV-1 Tat激活;AMPK的敲除會逆轉(zhuǎn)此過程。由此可見,PI3K/Akt/mTOR信號通路,PKM2及AMPK通過對自噬的調(diào)控作用于HIV-1 Tat的反式激活。丹參酮II A作為一個典型的抗氧化劑,通過促進促進核因子E2相關因子2(Nrf2)的表達來改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),逆轉(zhuǎn)Tat引起的活性氧(ROS)的產(chǎn)生及谷胱甘肽(GSH)水平的下降。在細胞中,Tat可以抑制沉默信息調(diào)節(jié)子2類似物1(SIRT1)蛋白的表達及活性,丹參酮II A的作用可以提高SIRT1蛋白的活性,但此過程并不涉及SIRT1蛋白表達的改變。同時,Tat可以抑制尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)蛋白的表達,并加快煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的消耗,丹參酮II A以劑量依賴的形式逆轉(zhuǎn)此過程;且丹參酮II A的這一作用是通過提高AMPK的磷酸化水平,激活AMPK信號通路介導的。最終,丹參酮II A通過氧化還原調(diào)控AMPK-Nampt-SIRT1通路抑制了HIV-1 Tat的反式激活。綜上所述,自噬參與調(diào)控了HIV-1 Tat的反式激活,而代謝相關因素可以通過調(diào)控自噬及Nampt-SIRT1通路來作用于HIV-1 Tat的激活。從自噬以及代謝的角度出發(fā),更加深入地了解宿主細胞-病毒之間相互作用,為我們從另一個新的角度研究抗病毒策略,發(fā)展新型抗病毒藥物提供了新的方向。
【關鍵詞】：Tat 自噬 M2型丙酮酸激酶 腺苷酸活化蛋白激酶 丹參酮II A
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文縮寫詞8-13
• 第1章 緒論13-27
• 1.1 HIV-1 概況13-16
• 1.1.1 HIV-1 Tat13-14
• 1.1.2 艾滋病治療現(xiàn)狀14-16
• 1.2 細胞自噬16-20
• 1.2.1 細胞自噬概述16
• 1.2.2 自噬的分類16-17
• 1.2.3 自噬的發(fā)生17-18
• 1.2.4 細胞自噬與病毒感染研究進展18-20
• 1.3 細胞代謝20-25
• 1.3.1 糖酵解20-21
• 1.3.2 M2型丙酮酸激酶（PKM2）21-22
• 1.3.3 AMPK22-23
• 1.3.4 代謝對自噬的調(diào)控23-24
• 1.3.5 病毒感染與細胞代謝的相互作用24-25
• 1.4 研究意義25-27
• 第2章 細胞自噬及代謝調(diào)控的自噬在HIV-1 Tat反式激活中的作用機制研究27-55
• 2.1 引言27-28
• 2.2 實驗材料28-31
• 2.2.1 實驗試劑的配制28-29
• 2.2.2 主要儀器29-30
• 2.2.3 試劑及耗材30
• 2.2.4 引物的設計、合成30
• 2.2.5 菌株及質(zhì)粒30-31
• 2.3 實驗方法31-37
• 2.3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及甘油菌制備31
• 2.3.2 質(zhì)粒提取及鑒定31-33
• 2.3.3 細胞培養(yǎng)33
• 2.3.4 細胞轉(zhuǎn)染33-34
• 2.3.5 Real-time PCR檢測34-35
• 2.3.6 Western Blot檢測35-36
• 2.3.7 MAGI實驗36-37
• 2.3.8 統(tǒng)計分析處理方法37
• 2.4 實驗結果37-52
• 2.4.1 HIV-1 Tat及PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑對自噬的影響37-41
• 2.4.2 Tat對Akt/mTOR信號通路的作用41-42
• 2.4.3 PKM2對自噬及Akt/mTOR信號通路的影響42-46
• 2.4.4 AMPK對自噬及Akt/mTOR信號通路的影響46-51
• 2.4.5 PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑、PKM2及AMPK對HIV-1 Tat反式激活的影響51-52
• 2.5 討論52-54
• 2.6 本章小結54-55
• 第3章 丹參酮II A氧化還原調(diào)控AMPK/Nampt通路從而抑制HIV-1 Tat激活55-67
• 3.1 引言55
• 3.2 實驗材料55-56
• 3.2.1 試劑及耗材55-56
• 3.3 實驗方法56-58
• 3.3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及甘油菌制備56
• 3.3.2 質(zhì)粒提取及鑒定56
• 3.3.3 細胞培養(yǎng)56
• 3.3.4 細胞轉(zhuǎn)染56
• 3.3.5 NAD+及NAD+/NADH比值檢測56-57
• 3.3.6 細胞內(nèi)GSH水平檢測57
• 3.3.7 ROS檢測57
• 3.3.8 SIRT1活性檢測57-58
• 3.3.9 Real-time PCR58
• 3.3.10 western blot58
• 3.3.11熒光素酶檢測58
• 3.3.12統(tǒng)計分析處理方法58
• 3.4 實驗結果58-65
• 3.4.1 Tat及丹參酮IIA對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響58-60
• 3.4.2 Tat及丹參酮II A對SIRT1的影響60-61
• 3.4.3 丹參酮II A對Tat處理的細胞中Nampt表達及NAD+水平的影響61-62
• 3.4.4 丹參酮II A誘導的Nampt的表達由AMPK通路介導62-64
• 3.4.5 丹參酮II A通過AMPK-Nampt通路抑制HIV-1 Tat的反式激活64-65
• 3.5 討論65-66
• 3.6 本章小結66-67
• 結論67-69
• 參考文獻69-77
• 攻讀碩士學位期間所發(fā)表的學術論文77-79
• 致謝79

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