本文關(guān)鍵詞：水中甲肝病毒濃縮方法初探及我國部分流行株遺傳特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus, HAV)引起的以肝臟炎癥病變?yōu)橹鞯膫魅拘约膊�。HAV僅有一個血清型,有六種基因型,主要通過糞口途徑傳播。水源性或食源性甲肝爆發(fā)危害人類的健康,檢測食物或水中的HAV對食品安全或飲用水安全具有重要意義。由于水中HAV含量較少,難以直接檢測,因此,對水中HAV進行濃縮成為當下研究的熱點問題。本研究采用Zetapor陽離子濾膜過濾和聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)沉淀對水中的HAV進行濃縮,之后采用Taqman熒光定量RT-PCR進行檢測。對PEG沉淀條件和Zetapor陽離子濾膜過濾條件進行了優(yōu)化,分別采用加入甲肝減毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine, HepA-L)的超純水和礦泉水模擬受HAV污染的水樣,以不加HepA-L的超純水或礦泉水作為陰性對照,探討了玻璃瓶和塑料瓶對HAV濃縮效果的影響。比較不同PEG濃度及氯化鈉(NaCl)濃度條件下的濃縮效果發(fā)現(xiàn),當PEG終濃度為10%、NaCl終濃度為1.0M時,PEG沉淀效果較好。比較不同流速條件下Zetapor陽離子濾膜過濾濃縮效果發(fā)現(xiàn),當流速為3L/h時,Zetapor陽離子濾膜的濃縮效果較好。在最優(yōu)條件下,1.5L超純水中的HAV經(jīng)Zetapor陽離子濾膜過濾初次濃縮及PEG沉淀二次濃縮后的檢出下限約是0.2 TCID50/mL。以優(yōu)化后的條件濃縮的總回收率為0.38%～0.88%。盛放待測水樣的容器影響Zetapor陽離子濾膜過濾濃縮HAV的效果,塑料瓶對HAV的吸附能力大于玻璃瓶。采用某品牌礦泉水模擬受HAV污染的水樣,經(jīng)二次濃縮后與超純水中HAV的濃縮結(jié)果無差別。本研究優(yōu)化了Zetapor陽離子濾膜過濾和PEG沉淀濃縮水中HAV的條件,采用熒光定量RT-PCR進行檢測；采用加入HepA-L的超純水和礦泉水模擬受HAV污染的水樣,為后續(xù)水中HAV濃縮方法的優(yōu)化提供了一定的實驗基礎(chǔ)。目前,HAV僅有一個血清型,其中和抗原位點主要位于結(jié)構(gòu)蛋白VP3、VP1區(qū)。對HAV流行株結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)進行基因特征及分子進化等遺傳特性分析,可以了解其基因型別和氨基酸序列特點、推導(dǎo)其起源時間和進化速率,為HAV的溯源研究及甲肝的預(yù)防控制策略提供有力的理論和技術(shù)支持。本研究從我國4個省份收集的39份2012年-2014年甲肝患者急性期血清樣本及2份國產(chǎn)市售甲肝減毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine, HepA-L)標本中提取HAV核酸,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增得到HAV結(jié)構(gòu)-非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)VP3～VP1-2A編碼區(qū)核苷酸序列,進行基因親緣關(guān)系及核苷酸序列同源性、氨基酸序列同源性、選擇壓力、分子進化等分析。本研究檢測到的39條HAV流行株序列均為IA亞型,其在結(jié)構(gòu)-非結(jié)構(gòu)蛋白VP3～VP1-2A編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列同源性分別為94.8%～100%和99.3%～100%,與檢測的2份HepA-L標本的核苷酸和氨基酸序列同源性為90.6%～91.9%和99.1%～99.4%。其中的1條序列在VP3-56位,發(fā)生絲氨酸(Serine,Ser)→脯氨酸(Proline, Pro)替代；3條序列在VP1-112位,發(fā)生蘇氨酸(Threonine,Thr)→異亮氨酸(Isoleucine, Ile)替代,靠近中和抗原位點VP1-114位；所有序列在已發(fā)表的中和抗原位點處氨基酸無變化。選擇壓力分析表明,檢測到的HAV流行株序列在VP3～VP1編碼區(qū)處于負向選擇。檢測的2份HepA-L標本序列均為IB亞型,在己發(fā)表的中和抗原位點處氨基酸無變化。基于結(jié)構(gòu)-非結(jié)構(gòu)蛋白VP3～VP1-2A區(qū)核苷酸序列,對包括本研究30條HAV流行株序列在內(nèi)的我國基因Ⅰ型HAV流行株進行分子進化分析,在最優(yōu)模型下,我國基因Ⅰ型HAV的平均替換率為5.56×10-4 substitutions/site/year,其最早共同祖先約是180年前。Bayesian Skyline曲線顯示自20世紀90年代中期至今,我國基因Ⅰ型HAV的種群數(shù)量呈明顯下降趨勢。本研究對我國部分HAV流行株結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)進行了基因特征及分子進化等遺傳特性分析,證實了HAV的結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)核苷酸序列存在一定差異,但氨基酸序列相對保守,HAV流行株在該區(qū)內(nèi)處于負向選擇,同時對我國基因Ⅰ型HAV的進化有一定的了解,為進一步研究HAV的分子流行病學(xué)和全面了解我國HAV進化提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：甲型肝炎病毒 水 濃縮 基因特征 分子進化
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.61
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 第一部分 水中甲肝病毒濃縮方法初探12-38
• 前言12-15
• 實驗材料15-17
• 實驗方法17-24
• 實驗結(jié)果24-34
• 實驗討論34-37
• 小結(jié)37-38
• 第二部分 我國部分甲肝病毒流行株遺傳特性分析38-64
• 前言38-41
• 實驗材料41-43
• 實驗方法43-51
• 實驗結(jié)果51-60
• 實驗討論60-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻64-67
• 綜述：環(huán)境水體中甲型肝炎病毒的濃縮方法研究進展67-74
• 1. 吸附洗脫法67-69
• 2. 超濾法69
• 3. 超速離心法69-70
• 4. 聚乙二醇沉淀法70
• 5. 新方法70-71
• 6. 總結(jié)與展望71-72
• 參考文獻72-74
• 致謝74

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