本文關(guān)鍵詞：漢防己甲素對(duì)伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉增效活性及其主要機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討漢防己甲素(tetrandrine,TET)對(duì)伊曲康唑(itraconazole,ITR)和伏立康唑(voriconazole,VRC)抗煙曲霉有無(wú)增效活性及其主要增效機(jī)制。方法參照M38-A方案的微量稀釋法,以23株煙曲霉臨床株為研究對(duì)象,測(cè)定TET對(duì)其的最大非細(xì)胞毒性劑量和ITR、VRC單獨(dú)及聯(lián)合TET對(duì)其的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MICs);參照M38-A2方案的棋盤微量稀釋法,測(cè)定ITR或VRC單獨(dú)及聯(lián)合TET抗23株煙曲霉臨床株活性,結(jié)合FICI(fractional inhibitory concentration index)法和ΔE法對(duì)其結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià);用時(shí)間-殺菌曲線法動(dòng)態(tài)觀察TET對(duì)ITR或VRC體外抗敏感株AF17和耐藥株AF23活性。以煙曲霉構(gòu)建小鼠系統(tǒng)感染模型,ITR或VRC單獨(dú)及聯(lián)合TET治療后,從生存率和病原學(xué)判斷其作用效果;用R6G外排法和RT-PCR法分別測(cè)定外排泵功能及其相關(guān)基因MDR1、MDR2、MDR3、MDR4和ATRF于ITR或VRC單獨(dú)及聯(lián)合TET作用后的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果TET抗煙曲霉的最大非細(xì)胞毒性劑量為80μg/m L。ITR單獨(dú)及聯(lián)合TET對(duì)煙曲霉的MIC值范圍分別為0.5μg/m L~32μg/m L和0.0625μg/m L~4μg/m L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);VRC單獨(dú)及聯(lián)合TET的MIC值范圍分別為0.25μg/m L~2μg/m L和0.03125μg/m L~0.25μg/m L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);ITR聯(lián)合TET作用時(shí),ITR的MIC值由0.125~32μg/m L降至0.0625~2μg/m L,TET的MIC值由256~512μg/m L降至8~64μg/m L,FICI和ΔE法評(píng)價(jià)均表現(xiàn)為協(xié)同作用;VRC聯(lián)合TET作用時(shí),VRC的MIC值由0.125~2μg/m L降至0.03~0.5μg/m L,TET的MIC值由256~512μg/m L降至8~256μg/m L,FICI和ΔE法評(píng)價(jià)17株菌表現(xiàn)為協(xié)同作用,6株菌表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用;時(shí)間殺菌曲線示:不同濃度的ITR或VRC聯(lián)合TET比其單獨(dú)作用均降低煙曲霉的細(xì)胞活性,并且縮短抑菌作用的時(shí)間。ITR或VRC聯(lián)合TET比其單獨(dú)作用均可提高小鼠的生存率(P0.05)和降低腎、腦負(fù)荷的煙曲霉菌量(P0.05)。TET可減少煙曲霉對(duì)R6G的外排;ITR或VRC聯(lián)合TET比其單獨(dú)作用的外排泵基因MDR2、MDR3、MDR4和ATRF低表達(dá)(P0.05)。結(jié)論漢防己甲素在體外及小鼠體內(nèi)對(duì)伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉有增效活性;其增效活性與其抑制藥物外排功能有關(guān),可能與下調(diào)外排泵基因MDR2、MDR3、MDR4和ATRF的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：漢防己甲素 伊曲康唑 伏立康唑 煙曲霉 增效作用 機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R756
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 前言11-20
• 1 煙曲霉感染的流行病學(xué)現(xiàn)狀11-12
• 2 臨床煙曲霉感染的治療現(xiàn)狀12
• 3 煙曲霉對(duì)唑類藥物耐藥機(jī)制12-14
• 4 應(yīng)對(duì)唑類抗真菌藥物耐藥所采取的策略和分析14-16
• 5 漢防己甲素概況及其作為唑類藥物增效劑的研究進(jìn)展16-18
• 6 本研究的內(nèi)容、創(chuàng)新性及意義18-20
• 第一部分 漢防己甲素對(duì)伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉體外增效活性研究20-42
• （一）以微量稀釋法測(cè)定最大非細(xì)胞毒性劑量漢防己甲素對(duì)伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉活性20-25
• 1 材料20-21
• 1.1 菌株20
• 1.2 藥物20
• 1.3 主要試劑20-21
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備21
• 1.5 藥物與主要試劑的配制21
• 2 方法21-22
• 2.1 菌株的保存與活化21-22
• 2.2 菌懸液制備22
• 2.3 TET對(duì)23株煙曲霉孢子相的最大非細(xì)胞毒性劑量測(cè)定22
• 2.4 ITR或VRC單獨(dú)及聯(lián)合最大非細(xì)胞毒性劑量的 TET 抗煙曲霉活性測(cè)定22
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析22
• 3 結(jié)果22-25
• 3.1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)22
• 3.2 TET對(duì)煙曲霉的非細(xì)胞毒性劑量22-23
• 3.3 ITR或VRC單獨(dú)及聯(lián)合TET抗煙曲霉活性23-25
• （二）以棋盤式微量液基稀釋法測(cè)定并評(píng)價(jià)漢防己甲素與伊曲康唑和伏立康唑的體外靜態(tài)聯(lián)合抗煙曲霉作用25-33
• 1 材料25-26
• 1.1 菌株25
• 1.2 藥物25
• 1.3 主要試劑25
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備25-26
• 1.5 藥物與主要試劑的配制26
• 2 方法26-28
• 2.1 菌株的保存與活化26
• 2.2 菌懸液配制26-27
• 2.3 用棋盤法測(cè)定TET聯(lián)合ITR或VRC抗煙曲霉活性27
• 2.4 藥物聯(lián)合作用效果的評(píng)價(jià) 采用FICI法和ΔE法對(duì)棋盤式微量液基稀釋法27-28
• 3 結(jié)果28-33
• 3.1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)28
• 3.2 棋盤法測(cè)定藥物對(duì)煙曲霉的活性28
• 3.3 藥物聯(lián)合作用效果的評(píng)價(jià)28-33
• （三）以時(shí)間-殺菌曲線法測(cè)定并評(píng)價(jià)漢防己甲素與伊曲康唑和伏立康唑的體外動(dòng)態(tài)聯(lián)合抗煙曲霉作用33-42
• 1 材料33-34
• 1.1 菌株33
• 1.2 藥物33
• 1.3 主要試劑33
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備33-34
• 1.5 藥物與主要試劑的配制34
• 2 方法34-35
• 2.1 菌株的保存與活化34
• 2.2 菌懸液制備34-35
• 2.3 時(shí)間-殺菌作用體系的制備35
• 2.4 時(shí)間-殺菌作用體系的測(cè)定35
• 3 結(jié)果35-39
• 4 討論39-41
• 5 小結(jié)41-42
• 第二部分 漢防己甲素對(duì)伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉體內(nèi)增效活性研究42-50
• 1 材料42-43
• 1.1 菌株42
• 1.2 藥物42
• 1.3 主要試劑42
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備42-43
• 1.5 藥物與主要試劑的配制43
• 2 方法43-44
• 2.1 菌株的保存與活化43
• 2.2 菌懸液配制43
• 2.3 小鼠43
• 2.4 小鼠免疫抑制與系統(tǒng)造模43
• 2.5 分組及給藥43-44
• 2.6 療效評(píng)價(jià)44
• 3 結(jié)果44-48
• 3.1 小鼠生存率44-46
• 3.2 病原學(xué)檢查46-48
• 4 討論48-49
• 5 小結(jié)49-50
• 第三部分 漢防己甲素對(duì)伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉增效活性機(jī)制研究50-66
• （一）采用R6G外排法測(cè)定TET對(duì)煙曲霉外排泵功能影響50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 菌株50
• 1.2 藥物50
• 1.3 主要試劑50
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備50-51
• 1.5 藥物與主要試劑的配制51
• 2 方法51-53
• 2.1 菌株的保存與活化51
• 2.2 菌懸液配制51-52
• 2.3 羅丹明 6G (R6G) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立52
• 2.4 煙曲霉細(xì)胞對(duì)R6G的吸收和外排52-53
• 3 結(jié)果53-57
• 3.1 R6G標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立53
• 3.2 煙曲霉對(duì)R6G的吸收53-54
• 3.3 煙曲霉對(duì)R6G的外排54-57
• （二）采用RT-PCR法測(cè)定外排泵相關(guān)基因藥物作用前后的相對(duì)表達(dá)量57-66
• 1 材料57-58
• 1.1 菌株57
• 1.2 藥物57
• 1.3 主要試劑57
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備57-58
• 1.5 藥物與主要試劑的配制58
• 2 方法58-62
• 2.1 菌株的保存與活化58
• 2.2 菌懸液配制58
• 2.3 藥物處理菌液58-59
• 2.4 菌體RNA提取59
• 2.5 樣品RNA純化59-60
• 2.6 樣品RNA質(zhì)量鑒定60
• 2.7 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA60
• 2.8 實(shí)時(shí)熒光PCR60-61
• 2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析61-62
• 3 結(jié)果62-64
• 3.1 外排泵基因的m RNA水平的相對(duì)表達(dá)量62
• 3.2 藥物作用后外排泵基因m RNA水平相對(duì)表達(dá)量62-64
• 4 討論64-65
• 5 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-68
• 縮略詞表68-69
• 參考文獻(xiàn)69-80
• 附錄80-82
• 致謝82

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