目的:克隆、表達并純化弓形蟲重組蛋白GRA7,分析其檢測弓形蟲感染的能力,為弓形蟲病診斷提供新的實驗依據(jù)。方法:(1)根據(jù)GenBank中弓形蟲GRA7基因序列設(shè)計并合成引物,以弓形蟲RH株基因組DNA為模版,利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增GRA7基因片段,將目的基因克隆至pMD-18T載體,經(jīng)過菌落PCR、雙酶切和測序鑒定陽性菌落。(2)將序列正確的GRA7基因亞克隆至表達載體pET-28a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-GRA7。將pET-28a-GRA7轉(zhuǎn)化E.coliBL21,篩選出陽性菌株并加以擴增,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達重組蛋白GRA7,采用超聲裂解法裂解菌體,His-bindrM柱層析(Ni2+-NTA)純化重組蛋白,Western-blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性,ELISA檢測弓形蟲感染者血清中的IgG和IgM,評價其診斷弓形蟲感染的價值。結(jié)果:(1)克隆獲得約630bp的GRA7基因,成功構(gòu)建了原核重組表達質(zhì)粒pET-28a-GRA7;(2)經(jīng)表達和純化后獲得分子量約33kDa的GRA7重組蛋白,Western-blot顯示該重組蛋白能與...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．ＧＲＡ７基因的擴增Ｍ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；?１：?ＧＲＡ７；?２：陰性對照；??

Ｍ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；?１：?ＧＲＡ７鑒定：??及雙酶切鑒定圖譜分別見０ｂｐ的片段，與目的基因大６００ｂｐ的基因片段；重組質(zhì)得ＧＲＡ７基因與發(fā)表在Ｇ同源性達９９％，第１８９位為同義突變。說明ＧＲＡ７

圖２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?

圖２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?圖３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??１：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ產(chǎn)物；?１：空白對照；??２：陰性對照?２：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｓｃｏｒｅ?ｔｘｐｅｔｖｌ?ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ?Ｇ....

圖３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶切鑒定??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??

圖２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?圖３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??１：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ產(chǎn)物；?１：空白對照；??２：陰性對照?２：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｓｃｏｒｅ?ｔｘｐｅｔｖｌ?ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ?Ｇ....

圖７．ＧＲＡ７表達產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??

３：空白對照??３．重組ＧＲＡ７蛋白的誘導(dǎo)表達及純化??重組ｐＥＴ－２８ａ－ＧＲＡ７誘導(dǎo)表達后產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結(jié)果見圖７。由圖７可見，??相比于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后的重組菌在約３３ｋＤａ處的蛋白條帶更為明顯，與預(yù)計重??組蛋白的大小相符；誘導(dǎo)表達后的重組蛋白以可溶性蛋白為主；經(jīng)金....

本文編號：3955566