發(fā)布時(shí)間：2024-04-15 02:04

　　目的:克隆、表達(dá)并純化弓形蟲重組蛋白GRA7,分析其檢測(cè)弓形蟲感染的能力,為弓形蟲病診斷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)根據(jù)GenBank中弓形蟲GRA7基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,以弓形蟲RH株基因組DNA為模版,利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增GRA7基因片段,將目的基因克隆至pMD-18T載體,經(jīng)過菌落PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定陽(yáng)性菌落。(2)將序列正確的GRA7基因亞克隆至表達(dá)載體pET-28a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-GRA7。將pET-28a-GRA7轉(zhuǎn)化E.coliBL21,篩選出陽(yáng)性菌株并加以擴(kuò)增,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白GRA7,采用超聲裂解法裂解菌體,His-bindrM柱層析(Ni2+-NTA)純化重組蛋白,Western-blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性,ELISA檢測(cè)弓形蟲感染者血清中的IgG和IgM,評(píng)價(jià)其診斷弓形蟲感染的價(jià)值。結(jié)果:(1)克隆獲得約630bp的GRA7基因,成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-GRA7;(2)經(jīng)表達(dá)和純化后獲得分子量約33kDa的GRA7重組蛋白,Western-blot顯示該重組蛋白能與...

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．ＧＲＡ７基因的擴(kuò)增Ｍ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；?１：?ＧＲＡ７；?２：陰性對(duì)照；??

Ｍ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；?１：?ＧＲＡ７鑒定：??及雙酶切鑒定圖譜分別見０ｂｐ的片段，與目的基因大６００ｂｐ的基因片段；重組質(zhì)得ＧＲＡ７基因與發(fā)表在Ｇ同源性達(dá)９９％，第１８９位為同義突變。說明ＧＲＡ７

圖２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?

圖２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?圖３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??１：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ產(chǎn)物；?１：空白對(duì)照；??２：陰性對(duì)照?２：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｓｃｏｒｅ?ｔｘｐｅｔｖｌ?ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ?Ｇ....

圖３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶切鑒定??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??

圖２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?圖３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??１：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ產(chǎn)物；?１：空白對(duì)照；??２：陰性對(duì)照?２：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的雙酶Ｓｃｏｒｅ?ｔｘｐｅｔｖｌ?ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ?Ｇ....

圖７．ＧＲＡ７表達(dá)產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??

３：空白對(duì)照??３．重組ＧＲＡ７蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化??重組ｐＥＴ－２８ａ－ＧＲＡ７誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結(jié)果見圖７。由圖７可見，??相比于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后的重組菌在約３３ｋＤａ處的蛋白條帶更為明顯，與預(yù)計(jì)重??組蛋白的大小相符；誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白以可溶性蛋白為主；經(jīng)金....

本文編號(hào)：3955566