本文關(guān)鍵詞：云南大理HIV陽性者感染弓形蟲SAG1、c22-8基因位點的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：弓形蟲是一種分布廣泛的機會致病原蟲,寄生于包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物的有核細胞內(nèi)。該蟲是一種廣泛分布的頂復門寄生原蟲,具有廣泛的宿主群,呈世界性分布,人和許多動物均可感染,引起人畜共患弓形蟲病。弓形蟲屬機會致病原蟲,孕婦和免疫功能低下者感染弓形蟲可造成嚴重危害。近年來,隨著寵物飼養(yǎng)愛好者及腫瘤患者、AIDS病人等免疫功能低下人群的逐漸增多,弓形蟲的危害也日益凸顯。弓形蟲發(fā)育過程形態(tài)多樣,生活史復雜,可分為有性生殖和無性生殖兩個階段,生活史中速殖子和緩殖子(包囊)是其主要的傳播和致病階段。其中無性生殖的速殖子階段危害較為嚴重。當速殖子進入宿主腦內(nèi)就會形成包囊引起慢性感染,弓形蟲的慢性感染占人類弓形蟲感染的絕大部分,也是最主要的表現(xiàn)形式,慢性弓形蟲感染會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。目前,已知弓形蟲僅有一個種,但存在著不同的基因型。除典型的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型外還有至少138個非典型基因型。世界范圍內(nèi),弓形蟲基因型的分布具有地域性。通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP),多位點酶電泳(MLEE)、微衛(wèi)星分析等技術(shù)將弓形蟲分為三個主要的譜系,分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。除此以外還有一些特殊的非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基因型,被定義為非典型基因型。它們在DNA序列上僅有1%-2%的微小差別,但毒力卻存在很大差異。Ⅰ型屬于強毒株(如RH株),致病性很強,輸注1個速殖子就能引起小鼠死亡,產(chǎn)生高度蟲血癥,與急性期感染相關(guān)。Ⅱ、Ⅲ型屬于弱毒株(如CEP株),對小鼠的致死劑量超過1000,Ⅱ型與慢性感染有關(guān)。通過對弓形蟲進行基因分析可以發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的弓形蟲分離株在遺傳上有不同的多樣性,基因型的不同導致蟲體的致病力及對藥物的敏感性存在差異。對弓形蟲的基因進行分析,可以為弓形蟲病的診斷和治療提供依據(jù)。本實驗通過采集云南大理HIV陽性者的血液,對全血樣本進行基因提取,運用巢式PCR和RFLP等技術(shù)分析,與弓形蟲國際標準株進行比對,對云南大理HIV陽性者感染弓形蟲的SAG1、c22-8基因位點進行初步分析,為發(fā)病機制和感染免疫的深入研究及臨床治療提供依據(jù)。1. 研究目的1.1 初步了解云南大理HIV陽性者弓形蟲感染情況。1.2 初步對云南大理HIV陽性者感染弓形蟲SAG1、c22-8基因進行分析,為進一步的分子遺傳學研究以及弓形蟲病的防制提供資料。2. 研究方法2.1 樣本收集收集云南省大理市艾滋病防治機構(gòu)的HIV陽性者血液樣本291份,均經(jīng)蛋白印跡(WB)試驗陽性確證。2.2 弓形蟲基因提取及擴增、回收、純化采用全血基因提取試劑盒對HIV陽性者弓形蟲血液樣本進行基因提取,引用國際上成熟的引物及巢氏PCR技術(shù)對弓形蟲SAG1、c22-8基因進行擴增,經(jīng)兩輪擴增后電泳,全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析。對弓形蟲SAG1、c22-8基因擴增陽性的樣本,用凝膠回收試劑盒進行回收、純化。2.3 酶切弓形蟲SAG1基因擴增陽性產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Sau96I和HaeⅡ, c22-8基因擴增陽性產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsmAI和MboⅡ酶切,酶切后電泳結(jié)果與弓形蟲標準株進行比對,對云南大理HIV陽性者感染的弓形蟲進行基因的初步分析。2.4 測序弓形蟲SAG1和c22-8基因擴增陽性樣本回收后送至上海立菲公司進行測序。測序結(jié)果采用DNAStar軟件系統(tǒng)進行分析,并與GenBank注冊的弓形蟲RH株的SAG1和c22-8進行比對分析。3. 結(jié)果3.1 本次共檢測291份血液樣本,其中弓形蟲SAG1基因成功擴增64份,c22-8基因成功擴增32份；SAG1基因分子生物學檢測陽性率為22.0%,c22-8基因分子生物學檢測陽性率為11.0%。3.2 云南大理HIV陽性者全血樣本291份,經(jīng)過基因抽提和巢氏PCR對弓形蟲SAG1、c22-8基因進行擴增后用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳,并采集圖樣。其中SAG1基因成功擴增64份,擴增的目的條帶片段為390bp；c22-8基因成功擴增32份,擴增的目的條帶片段為521bp。3.3 64份SAG1基因擴增陽性的產(chǎn)物經(jīng)Sau96I和HaeⅡ酶切后電泳,均可見2個條帶,分別約為350bp和50bp；32份c22-8基因擴增陽性產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsmAI和MboⅡ酶切后電泳,均可見3個條帶,分別約為120bp、240bp和20bp；與標準基因工型株(RH株)相一致。3.4 選擇樣本擴增陽性的弓形蟲 SAG1、c22-8基因進行序列測定后,與Genbank上注冊的弓形蟲SAG1、c22-8基因(登錄號為GQ253073.1、AM055943.1)序列進行比對,發(fā)現(xiàn)上述基因的堿基對之間存在少量的轉(zhuǎn)換和缺失。4. 結(jié)論4.1 采用巢式PCR從云南大理HIV陽性者感染弓形蟲的全血標本中成功擴增出SAG1基因64份,陽性率為22.0%；c22-8基因32份,陽性率為11.0%；SAG1基因位點檢測陽性率高于c22-8。4.2 云南大理HIV陽性者感染弓形蟲株酶切結(jié)果與國際標準基因I型株(RH株)一致。4.3 云南大理HIV陽性者感染的弓形蟲SAG1、c22-8基因擴增陽性樣本的測序結(jié)果顯示,弓形蟲SAG1、c22-8基因與Genbank上注冊的弓形蟲RH株基因的堿基對之間的差異率非常小,表現(xiàn)為堿基對的轉(zhuǎn)換和缺失。4.4 云南大理HIV陽性者感染的弓形蟲是否還存在與國際標準基因工型株(RH株)不一致的情況,還有待進一步研究。5. 本實驗研究的創(chuàng)新點本實驗主要有以下三個方面的創(chuàng)新點：5.1 本實驗選擇云南大理地區(qū),該地域遼闊,資源豐富,氣候宜人且是以白族為主的多民族聚集地,初步了解了云南大理HIV陽性者感染弓形蟲遺傳多態(tài)性特點,具有明顯的地方特色。5,2 以弓形蟲高危人群(云南大理HIV陽性者)為研究對象,初步對云南大理HIV陽性者感染弓形蟲SAC1、c22-8基因進行分析。5.3 本實驗直接從HIV陽性者全血樣本中提取弓形蟲基因并成功擴增出弓形蟲SAG1基因、c22-8基因。
【關(guān)鍵詞】：HIV陽性 弓形蟲 巢氏PCR 限制性內(nèi)切酶 基因
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91;R531.8
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 1. 材料14-15
• 2. 方法15-24
• 3. 結(jié)果24-32
• 4. 討論32-35
• 全文小結(jié)35-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-43
• 附錄 (攻讀碩士期間發(fā)表的論文)43-44
• 綜述44-50
• 參考文獻48-50
• 致謝50

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 楊占軍,謝順清,呂曉嫻;惡性腫瘤患者并發(fā)弓形蟲感染抽樣調(diào)查[J];醫(yī)藥論壇雜志;2005年01期

2 華海涌;還錫萍;董美華;張燕;朱婕;徐曉霞;高琪;;HIV/AIDS患者中弓形蟲感染情況的調(diào)查[J];中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2009年05期

3 聶大平;尤英霞;申麗潔;李偉;;PCR衍生技術(shù)在剛地弓形蟲基因鑒定和分型中的應用[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2012年01期

4 李瑾;肖婷;黃炳成;仲維霞;修海迪;王英婷;韓廣東;魏慶寬;;弓形蟲pcDNA3-p30-ROP2-HSP70復合核酸疫苗免疫保護性的研究[J];中國人獸共患病學報;2012年01期

5 聶大平;賈玉璽;陳凌娟;尤英霞;李偉;申麗潔;;云南HIV陽性患者感染弓形蟲基因型的初步分析[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2013年05期

  本文關(guān)鍵詞：云南大理HIV陽性者感染弓形蟲SAG1、c22-8基因位點的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：394026