本文關鍵詞：煙曲霉果膠裂解酶A抗體檢測方法的建立及應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,隨著糖皮質激素和化療藥物的廣泛應用,實體器官移植、造血干細胞移植等的廣泛開展,侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的發(fā)病率顯著上升,且死亡率極高。早期診斷對IA的成功治療至關重要,但是目前的IA診斷方法存在檢測周期長、敏感性低等缺點,不能滿足臨床需要。國內(nèi)外學者正努力尋找用于IA早期診斷的生物標志物。課題組前期篩選了一批免疫優(yōu)勢抗原,首次發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶A (pectate lyase A, PlyA)與IA患者血清存在免疫反應,有望作為IA的診斷標志物。研究目的原核表達煙曲霉PlyA蛋白,建立檢測人血清中抗PlyA蛋白IgG類抗體的間接ELISA方法,評估其在IA診斷中的潛在價值。研究方法對煙曲霉PlyA的基因序列進行生物信息學分析,選擇大腸埃希菌偏愛的密碼子,進行基因序列優(yōu)化。委托生物公司合成編碼PlyA的DNA序列,并連接到pET28a表達載體,構建重組表達質粒。將重組質粒轉化大腸埃希菌BL21(DE3), IPTG誘導表達PlyA重組蛋白；Western blot分析重組蛋白質與抗His標簽蛋白(His-tag)單克隆抗體和侵襲性曲霉病患者血清中相應抗體的反應性。用重組PlyA包被微孔板,建立檢測抗PlyA抗體的間接ELISA方法,檢測IA病人血清,評估該方法對IA的診斷價值。分析了聯(lián)合檢測抗煙曲霉PlyA、TR和DPPV抗體的診斷效果。研究結果(1)同源性分析顯示煙曲霉PlyA與人蛋白質不存在同源性,與其他常見病原菌蛋白質的同源性較低。PlyA基因的密碼子優(yōu)化后,在保持氨基酸序列不變的條件下,DNA序列中有18.84%的核苷酸改變。合成基因并成功構建了重組PlyA表達載體,并誘導表達獲得帶有His標簽的PlyA蛋白。(2) Western blot結果表明煙曲霉PlyA可與抗His標簽抗體、IA患者血清發(fā)生特異性反應,但與其他侵襲性真菌感染病人(如侵襲性念珠菌病)血清和健康人血清無反應。(3)建立了檢測抗煙曲霉PlyA抗體的ELISA方法,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為5.3%,批間CV為10.9%,阻斷試驗阻斷率90%,顯示該方法具有良好穩(wěn)定性和特異性。(4)以該方法檢測IA患者血清,選擇臨界值為0.533時,該方法對IA診斷的敏感性51.5%,特異性94.3%。在非中性粒細胞缺乏的IA患者抗PlyA抗體陽性率高于中性粒細胞缺乏的IA患者�？筆lyA、抗TR和抗DPPV抗體聯(lián)合檢測的陽性率可提高到88.7%。結論本研究成功制備了煙曲霉PlyA的重組蛋白,建立了檢測抗PlyA抗體的ELISA法,并證明該方法對IA的早期診斷具有潛在的應用價值。
【關鍵詞】：侵襲性曲霉病 果膠裂解酶A 原核表達 ELISA方法
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6;R519
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 主要英文縮略詞表9-11
• 第一章 引言11-16
• 1.1 侵襲性曲霉病的診斷現(xiàn)狀11-14
• 1.1.1 臨床常用侵襲性曲霉病的實驗室診斷方法11-12
• 1.1.2 新興的IA診斷方法12-14
• 1.2 本論文研究的意義14-16
• 第二章 煙曲霉果膠裂解酶A的基因合成與原核表達16-30
• 2.1 實驗材料16-21
• 2.1.1 質粒與菌株16
• 2.1.2 主要試劑及工具酶16
• 2.1.3 清來源16
• 2.1.4 溶液配制16-21
• 2.1.5 主要儀器21
• 2.2 實驗方法21-26
• 2.2.1 煙曲霉PlyA的生物信息學分析21
• 2.2.2 煙曲霉PlyA目的基因的優(yōu)化與合成21-22
• 2.2.3 表達載體的構建與重組蛋白誘導表達22-24
• 2.2.4 重組PlyA蛋白的純化24-25
• 2.2.5 重組蛋白純度鑒定及抗原性分析25-26
• 2.3 實驗結果26-29
• 2.3.1 煙曲霉PlyA生物信息學分析結果26
• 2.3.2 煙曲霉PlyA目的基因的優(yōu)化與合成26-27
• 2.3.3 pET28a(+)/PlyA重組質粒的提取及鑒定27
• 2.3.4 重組蛋白的誘導表達及純化27-28
• 2.3.5 重組蛋白的抗原性分析28-29
• 2.4 討論29-30
• 第三章 檢測抗煙曲霉果膠裂解酶A抗體的ELISA方法建立30-34
• 3.1 實驗材料30
• 3.1.1 主要試劑及儀器30
• 3.1.2 清樣本30
• 3.1.3 溶液配置30
• 3.2 實驗方法30-31
• 3.2.1 PlyA重組蛋白質的制備30
• 3.2.2 ELISA方法的建立30-31
• 3.2.3 抗PlyA抗體檢測間接ELISA法的優(yōu)化31
• 3.2.4 抗PlyA抗體檢測間接ELISA法的方法學考核31
• 3.3 實驗結果31-32
• 3.3.1 ELISA反應的最佳反應條件31
• 3.3.2 精密度31-32
• 3.3.3 阻斷試驗32
• 3.4 討論32-34
• 第四章 ELISA方法檢測抗PlyA抗體對IA診斷價值的評估34-40
• 4.1 實驗材料34-35
• 4.1.1 血清標本來源34
• 4.1.2 主要試劑及儀器34-35
• 4.2 實驗方法35
• 4.2.1 煙曲霉PlyA、TR和DPPV重組蛋白的制備35
• 4.2.2 人血清抗PlyA抗體的測定35
• 4.2.3 臨界值的確定35
• 4.2.4 抗煙曲霉TR、DPPV抗體測定35
• 4.2.5 統(tǒng)計學分析35
• 4.3 實驗結果35-38
• 4.3.1 臨界值的確定35
• 4.3.2 IA患者血清抗PlyA抗體檢測結果與分析35-37
• 4.3.3 三種抗體檢測方法的比較和聯(lián)合診斷的價值37-38
• 4.4 討論38-40
• 第五章 主要結論及展望40-41
• 5.1 主要結論40
• 5.2 展望40-41
• 參考文獻41-45
• 附錄45-56
• 附錄A 煙曲霉PlyA同源性分析結果45-50
• 附錄B 煙曲霉PlyA基因合成圖50-53
• 附錄C IA患者臨床特征及血清抗PlyA、抗TR和抗DPPV檢測結果53-56
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文及參加學術的會議56-57
• 致謝57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李芳秋;;重新認識特異性抗體對侵襲性真菌病的診斷價值[J];醫(yī)學研究生學報;2012年04期

2 ;重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南(2007)[J];中華內(nèi)科雜志;2007年11期

  本文關鍵詞：煙曲霉果膠裂解酶A抗體檢測方法的建立及應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：382779