發(fā)布時(shí)間：2017-05-20 21:05

  本文關(guān)鍵詞：煙曲霉果膠裂解酶A抗體檢測方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,隨著糖皮質(zhì)激素和化療藥物的廣泛應(yīng)用,實(shí)體器官移植、造血干細(xì)胞移植等的廣泛開展,侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的發(fā)病率顯著上升,且死亡率極高。早期診斷對IA的成功治療至關(guān)重要,但是目前的IA診斷方法存在檢測周期長、敏感性低等缺點(diǎn),不能滿足臨床需要。國內(nèi)外學(xué)者正努力尋找用于IA早期診斷的生物標(biāo)志物。課題組前期篩選了一批免疫優(yōu)勢抗原,首次發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶A (pectate lyase A, PlyA)與IA患者血清存在免疫反應(yīng),有望作為IA的診斷標(biāo)志物。研究目的原核表達(dá)煙曲霉PlyA蛋白,建立檢測人血清中抗PlyA蛋白IgG類抗體的間接ELISA方法,評估其在IA診斷中的潛在價(jià)值。研究方法對煙曲霉PlyA的基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,選擇大腸埃希菌偏愛的密碼子,進(jìn)行基因序列優(yōu)化。委托生物公司合成編碼PlyA的DNA序列,并連接到pET28a表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3), IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PlyA重組蛋白；Western blot分析重組蛋白質(zhì)與抗His標(biāo)簽蛋白(His-tag)單克隆抗體和侵襲性曲霉病患者血清中相應(yīng)抗體的反應(yīng)性。用重組PlyA包被微孔板,建立檢測抗PlyA抗體的間接ELISA方法,檢測IA病人血清,評估該方法對IA的診斷價(jià)值。分析了聯(lián)合檢測抗煙曲霉PlyA、TR和DPPV抗體的診斷效果。研究結(jié)果(1)同源性分析顯示煙曲霉PlyA與人蛋白質(zhì)不存在同源性,與其他常見病原菌蛋白質(zhì)的同源性較低。PlyA基因的密碼子優(yōu)化后,在保持氨基酸序列不變的條件下,DNA序列中有18.84%的核苷酸改變。合成基因并成功構(gòu)建了重組PlyA表達(dá)載體,并誘導(dǎo)表達(dá)獲得帶有His標(biāo)簽的PlyA蛋白。(2) Western blot結(jié)果表明煙曲霉PlyA可與抗His標(biāo)簽抗體、IA患者血清發(fā)生特異性反應(yīng),但與其他侵襲性真菌感染病人(如侵襲性念珠菌病)血清和健康人血清無反應(yīng)。(3)建立了檢測抗煙曲霉PlyA抗體的ELISA方法,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為5.3%,批間CV為10.9%,阻斷試驗(yàn)阻斷率90%,顯示該方法具有良好穩(wěn)定性和特異性。(4)以該方法檢測IA患者血清,選擇臨界值為0.533時(shí),該方法對IA診斷的敏感性51.5%,特異性94.3%。在非中性粒細(xì)胞缺乏的IA患者抗PlyA抗體陽性率高于中性粒細(xì)胞缺乏的IA患者�？筆lyA、抗TR和抗DPPV抗體聯(lián)合檢測的陽性率可提高到88.7%。結(jié)論本研究成功制備了煙曲霉PlyA的重組蛋白,建立了檢測抗PlyA抗體的ELISA法,并證明該方法對IA的早期診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：侵襲性曲霉病 果膠裂解酶A 原核表達(dá) ELISA方法
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6;R519
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 主要英文縮略詞表9-11
• 第一章 引言11-16
• 1.1 侵襲性曲霉病的診斷現(xiàn)狀11-14
• 1.1.1 臨床常用侵襲性曲霉病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法11-12
• 1.1.2 新興的IA診斷方法12-14
• 1.2 本論文研究的意義14-16
• 第二章 煙曲霉果膠裂解酶A的基因合成與原核表達(dá)16-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 2.1.1 質(zhì)粒與菌株16
• 2.1.2 主要試劑及工具酶16
• 2.1.3 清來源16
• 2.1.4 溶液配制16-21
• 2.1.5 主要儀器21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 2.2.1 煙曲霉PlyA的生物信息學(xué)分析21
• 2.2.2 煙曲霉PlyA目的基因的優(yōu)化與合成21-22
• 2.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建與重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)22-24
• 2.2.4 重組PlyA蛋白的純化24-25
• 2.2.5 重組蛋白純度鑒定及抗原性分析25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 2.3.1 煙曲霉PlyA生物信息學(xué)分析結(jié)果26
• 2.3.2 煙曲霉PlyA目的基因的優(yōu)化與合成26-27
• 2.3.3 pET28a(+)/PlyA重組質(zhì)粒的提取及鑒定27
• 2.3.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化27-28
• 2.3.5 重組蛋白的抗原性分析28-29
• 2.4 討論29-30
• 第三章 檢測抗煙曲霉果膠裂解酶A抗體的ELISA方法建立30-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3.1.1 主要試劑及儀器30
• 3.1.2 清樣本30
• 3.1.3 溶液配置30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法30-31
• 3.2.1 PlyA重組蛋白質(zhì)的制備30
• 3.2.2 ELISA方法的建立30-31
• 3.2.3 抗PlyA抗體檢測間接ELISA法的優(yōu)化31
• 3.2.4 抗PlyA抗體檢測間接ELISA法的方法學(xué)考核31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-32
• 3.3.1 ELISA反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件31
• 3.3.2 精密度31-32
• 3.3.3 阻斷試驗(yàn)32
• 3.4 討論32-34
• 第四章 ELISA方法檢測抗PlyA抗體對IA診斷價(jià)值的評估34-40
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 4.1.1 血清標(biāo)本來源34
• 4.1.2 主要試劑及儀器34-35
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法35
• 4.2.1 煙曲霉PlyA、TR和DPPV重組蛋白的制備35
• 4.2.2 人血清抗PlyA抗體的測定35
• 4.2.3 臨界值的確定35
• 4.2.4 抗煙曲霉TR、DPPV抗體測定35
• 4.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-38
• 4.3.1 臨界值的確定35
• 4.3.2 IA患者血清抗PlyA抗體檢測結(jié)果與分析35-37
• 4.3.3 三種抗體檢測方法的比較和聯(lián)合診斷的價(jià)值37-38
• 4.4 討論38-40
• 第五章 主要結(jié)論及展望40-41
• 5.1 主要結(jié)論40
• 5.2 展望40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 附錄45-56
• 附錄A 煙曲霉PlyA同源性分析結(jié)果45-50
• 附錄B 煙曲霉PlyA基因合成圖50-53
• 附錄C IA患者臨床特征及血清抗PlyA、抗TR和抗DPPV檢測結(jié)果53-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文及參加學(xué)術(shù)的會(huì)議56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李芳秋;;重新認(rèn)識特異性抗體對侵襲性真菌病的診斷價(jià)值[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2012年04期

2 ;重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南(2007)[J];中華內(nèi)科雜志;2007年11期

  本文關(guān)鍵詞：煙曲霉果膠裂解酶A抗體檢測方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：382779