本文關(guān)鍵詞：六種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的原核表達(dá)及16 KD-38 KD和Ag85A血清學(xué)診斷效果的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：根據(jù)GenBank中公布的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,以H37Rv菌株的總DNA為模板,分別擴(kuò)增獲得fbpA(Ag85A)、fbpB(Ag85B)、 mpt64 (MPT64)、ppe57 (Rv3425)、esxB(CFP10)、hspX (16 KD) 和 pstS1 (38 KD)等七個(gè)目的基因。將純化后的fbpA、fbpB、mpt64、ppe57 和 esxB基因片段同pMD18-T載體連接,測序正確后,克隆入pET30a表達(dá)載體,經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu)建原核表達(dá)重組菌。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)BL21 (DE3)重組菌后,SDA-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示：Ag85B和CFP10為可溶性蛋白;Ag85A、MPT64和Rv3425主要為包涵體。以純化后的hspX和pstS1基因片段為模板,利用over-lap PCR擴(kuò)增獲得hspX-pstS1融合基因,克隆入pMD18-T載體,測序正確后,同pET30a表達(dá)載體連接,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),構(gòu)建原核表達(dá)重組菌。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)BL21 (DE3)重組菌后,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示16KD-38KD融合蛋白主要以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)。超聲破菌后,利用鎳離子親和層析柱純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白。將純化后的以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)的重組蛋白置于透析袋內(nèi),用4M尿素、2M尿素和PBS溶液梯度洗脫復(fù)性蛋白。分別以復(fù)性后的Ag85A 和 16KD-38 KD重組蛋白做為血清學(xué)檢測抗原包被酶標(biāo)板,利用間接ELISA法對427份結(jié)核陽性血清和356份結(jié)核陰性血清進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：抗原Ag85A共測出72份結(jié)核陽性血清,188份結(jié)核陰性血清,其敏感性為16.86%,特異性為52.81%,準(zhǔn)確性為33.21%；抗原16 KD-38KD共測出394份結(jié)核陽性血清,315份結(jié)核陰性血清,其敏感性為92.27%,特異性為88.48%,準(zhǔn)確性為90.55%。本研究成功構(gòu)建了MTB六種特異性抗原的原核表達(dá)重組質(zhì)粒,其開放閱讀框正確、無突變,重組蛋白可以進(jìn)行大量表達(dá)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示16 KD-38 KD具有較高的特異性和敏感性,可以作為結(jié)核病抗體檢測的候選抗原。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核病 原核表達(dá) Ag85A 16 KD-38 KD 血清學(xué)診斷
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 縮略詞表8-9
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述9-23
• 第一章 結(jié)核病的簡介9-12
• 1.1 結(jié)核病現(xiàn)狀9
• 1.2 結(jié)核分枝桿菌9-10
• 1.3 結(jié)核分枝桿菌的感染機(jī)制10-11
• 1.4 機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)制11-12
• 第二章 結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法12-17
• 2.1 細(xì)菌學(xué)診斷12-13
• 2.1.1 痰涂片鏡檢12
• 2.1.2 痰樣本培養(yǎng)12-13
• 2.2 血清學(xué)診斷13-14
• 2.3 結(jié)核菌素皮膚實(shí)驗(yàn)14
• 2.4 IFN-γ釋放試驗(yàn)14-15
• 2.5 DNA水平的診斷15-16
• 2.6 生物傳感器診斷16-17
• 第三章 六種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的研究進(jìn)展17-23
• 3.1 MPT6418
• 3.2 16KD18-19
• 3.3 38KD19-20
• 3.4 CFP1020-21
• 3.5 Rv342521
• 3.6 Ag85復(fù)合物21-23
• 第二部分 研究內(nèi)容23-62
• 第一章 六種MTB特異性抗原的原核表達(dá)及純化23-53
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-34
• 1.2.1 原核表達(dá)重組菌的構(gòu)建27-32
• 1.2.1.1 目的基因的擴(kuò)增27-29
• 1.2.1.2 PCR產(chǎn)物的膠回收29
• 1.2.1.3 pMD18-T和目的基因重組載體的構(gòu)建29
• 1.2.1.4 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞29
• 1.2.1.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定29-31
• 1.2.1.6 pMD18-T重組質(zhì)粒和pET-30a空載體的雙酶切31
• 1.2.1.7 目的基因和pET-30a空載體的連接31
• 1.2.1.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化31-32
• 1.2.1.9 重組菌的鑒定32
• 1.2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定32-33
• 1.2.2.1 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)條件的優(yōu)化32
• 1.2.2.2 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定32-33
• 1.2.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的定性分析33
• 1.2.3 重組蛋白的純化和復(fù)性33-34
• 1.2.3.1 重組蛋白的純化33-34
• 1.2.3.2 重組蛋白的復(fù)性34
• 1.3 結(jié)果34-48
• 1.3.1 抗原MPT64原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-37
• 1.3.2 抗原16KD-38KD融合蛋白原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-40
• 1.3.3 抗原CFP10原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-42
• 1.3.4 抗原Rv3425原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-44
• 1.3.5 抗原Ag85A原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 1.3.6 抗原Ag85B原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-48
• 1.4 討論48-52
• 1.5 小結(jié)52-53
• 第二章 Ag85A和16KD-38KD血清學(xué)診斷效果的研究53-62
• 2.1 材料53-54
• 2.1.1 主要試劑53
• 2.1.2 主要儀器53
• 2.1.3 ELISA反應(yīng)相關(guān)溶液的制備53-54
• 2.2 方法54-55
• 2.2.1 棋盤滴定法確定最適的抗原包被濃度和酶標(biāo)二抗的工作濃度54-55
• 2.2.1.1 包被54
• 2.2.1.2 封閉54
• 2.2.1.3 加待檢血清54-55
• 2.2.1.4 加HRP標(biāo)記的羊抗人IgG55
• 2.2.1.5 顯色55
• 2.2.1.6 終止55
• 2.2.2 間接ELISA法評價(jià)重組蛋白的血清學(xué)診斷效果55
• 2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ELISA檢測結(jié)果55
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-58
• 2.3.1 棋盤滴定法確定的最適抗原包被濃度和酶標(biāo)二抗的工作濃度55-58
• 2.3.2 Ag85A和16KD-38KD的血清學(xué)檢測結(jié)果58
• 2.4 討論58-61
• 2.5 小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳靜希;岳俊杰;姜永強(qiáng);郝淮杰;李艷;;結(jié)核分枝桿菌Rv3425特異性蛋白片段與CFP10-ESAT6融合蛋白在結(jié)核抗體檢測中的應(yīng)用價(jià)值[J];生物技術(shù)通訊;2011年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李紅霞;結(jié)核分枝桿菌特異性抗原/抗體ELISA檢測試劑盒的初步研究[D];四川大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：六種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的原核表達(dá)及16 KD-38 KD和Ag85A血清學(xué)診斷效果的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：380562