本文關鍵詞：六種結核分枝桿菌特異性抗原的原核表達及16 KD-38 KD和Ag85A血清學診斷效果的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：根據GenBank中公布的結核分枝桿菌H37Rv菌株的基因序列設計相應的引物,以H37Rv菌株的總DNA為模板,分別擴增獲得fbpA(Ag85A)、fbpB(Ag85B)、 mpt64 (MPT64)、ppe57 (Rv3425)、esxB(CFP10)、hspX (16 KD) 和 pstS1 (38 KD)等七個目的基因。將純化后的fbpA、fbpB、mpt64、ppe57 和 esxB基因片段同pMD18-T載體連接,測序正確后,克隆入pET30a表達載體,經PCR擴增和雙酶切鑒定正確后轉化大腸桿菌BL21(DE3)構建原核表達重組菌。IPTG誘導表達BL21 (DE3)重組菌后,SDA-PAGE鑒定重組蛋白的表達,結果顯示：Ag85B和CFP10為可溶性蛋白;Ag85A、MPT64和Rv3425主要為包涵體。以純化后的hspX和pstS1基因片段為模板,利用over-lap PCR擴增獲得hspX-pstS1融合基因,克隆入pMD18-T載體,測序正確后,同pET30a表達載體連接,經PCR和雙酶切鑒定正確后轉化大腸桿菌BL21(DE3),構建原核表達重組菌。IPTG誘導表達BL21 (DE3)重組菌后,SDS-PAGE電泳結果顯示16KD-38KD融合蛋白主要以包涵體的形式進行表達。超聲破菌后,利用鎳離子親和層析柱純化帶有His標簽的重組蛋白。將純化后的以包涵體形式進行表達的重組蛋白置于透析袋內,用4M尿素、2M尿素和PBS溶液梯度洗脫復性蛋白。分別以復性后的Ag85A 和 16KD-38 KD重組蛋白做為血清學檢測抗原包被酶標板,利用間接ELISA法對427份結核陽性血清和356份結核陰性血清進行檢測,實驗結果顯示：抗原Ag85A共測出72份結核陽性血清,188份結核陰性血清,其敏感性為16.86%,特異性為52.81%,準確性為33.21%；抗原16 KD-38KD共測出394份結核陽性血清,315份結核陰性血清,其敏感性為92.27%,特異性為88.48%,準確性為90.55%。本研究成功構建了MTB六種特異性抗原的原核表達重組質粒,其開放閱讀框正確、無突變,重組蛋白可以進行大量表達。ELISA實驗結果顯示16 KD-38 KD具有較高的特異性和敏感性,可以作為結核病抗體檢測的候選抗原。
【關鍵詞】：結核病 原核表達 Ag85A 16 KD-38 KD 血清學診斷
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 縮略詞表8-9
• 第一部分 文獻綜述9-23
• 第一章 結核病的簡介9-12
• 1.1 結核病現狀9
• 1.2 結核分枝桿菌9-10
• 1.3 結核分枝桿菌的感染機制10-11
• 1.4 機體的免疫應答機制11-12
• 第二章 結核病的實驗室診斷方法12-17
• 2.1 細菌學診斷12-13
• 2.1.1 痰涂片鏡檢12
• 2.1.2 痰樣本培養(yǎng)12-13
• 2.2 血清學診斷13-14
• 2.3 結核菌素皮膚實驗14
• 2.4 IFN-γ釋放試驗14-15
• 2.5 DNA水平的診斷15-16
• 2.6 生物傳感器診斷16-17
• 第三章 六種結核分枝桿菌特異性抗原的研究進展17-23
• 3.1 MPT6418
• 3.2 16KD18-19
• 3.3 38KD19-20
• 3.4 CFP1020-21
• 3.5 Rv342521
• 3.6 Ag85復合物21-23
• 第二部分 研究內容23-62
• 第一章 六種MTB特異性抗原的原核表達及純化23-53
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-34
• 1.2.1 原核表達重組菌的構建27-32
• 1.2.1.1 目的基因的擴增27-29
• 1.2.1.2 PCR產物的膠回收29
• 1.2.1.3 pMD18-T和目的基因重組載體的構建29
• 1.2.1.4 轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞29
• 1.2.1.5 轉化產物的鑒定29-31
• 1.2.1.6 pMD18-T重組質粒和pET-30a空載體的雙酶切31
• 1.2.1.7 目的基因和pET-30a空載體的連接31
• 1.2.1.8 連接產物的轉化31-32
• 1.2.1.9 重組菌的鑒定32
• 1.2.2 重組菌的誘導表達、表達條件的優(yōu)化及表達產物的鑒定32-33
• 1.2.2.1 重組菌的誘導表達和表達條件的優(yōu)化32
• 1.2.2.2 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定32-33
• 1.2.2.3 表達產物的定性分析33
• 1.2.3 重組蛋白的純化和復性33-34
• 1.2.3.1 重組蛋白的純化33-34
• 1.2.3.2 重組蛋白的復性34
• 1.3 結果34-48
• 1.3.1 抗原MPT64原核表達實驗結果34-37
• 1.3.2 抗原16KD-38KD融合蛋白原核表達實驗結果37-40
• 1.3.3 抗原CFP10原核表達實驗結果40-42
• 1.3.4 抗原Rv3425原核表達實驗結果42-44
• 1.3.5 抗原Ag85A原核表達實驗結果44-46
• 1.3.6 抗原Ag85B原核表達實驗結果46-48
• 1.4 討論48-52
• 1.5 小結52-53
• 第二章 Ag85A和16KD-38KD血清學診斷效果的研究53-62
• 2.1 材料53-54
• 2.1.1 主要試劑53
• 2.1.2 主要儀器53
• 2.1.3 ELISA反應相關溶液的制備53-54
• 2.2 方法54-55
• 2.2.1 棋盤滴定法確定最適的抗原包被濃度和酶標二抗的工作濃度54-55
• 2.2.1.1 包被54
• 2.2.1.2 封閉54
• 2.2.1.3 加待檢血清54-55
• 2.2.1.4 加HRP標記的羊抗人IgG55
• 2.2.1.5 顯色55
• 2.2.1.6 終止55
• 2.2.2 間接ELISA法評價重組蛋白的血清學診斷效果55
• 2.2.3 統計學分析ELISA檢測結果55
• 2.3 實驗結果55-58
• 2.3.1 棋盤滴定法確定的最適抗原包被濃度和酶標二抗的工作濃度55-58
• 2.3.2 Ag85A和16KD-38KD的血清學檢測結果58
• 2.4 討論58-61
• 2.5 小結61-62
• 參考文獻62-69
• 致謝69

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 吳靜希;岳俊杰;姜永強;郝淮杰;李艷;;結核分枝桿菌Rv3425特異性蛋白片段與CFP10-ESAT6融合蛋白在結核抗體檢測中的應用價值[J];生物技術通訊;2011年03期

中國博士學位論文全文數據庫 前1條

1 李紅霞;結核分枝桿菌特異性抗原/抗體ELISA檢測試劑盒的初步研究[D];四川大學;2007年

  本文關鍵詞：六種結核分枝桿菌特異性抗原的原核表達及16 KD-38 KD和Ag85A血清學診斷效果的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：380562