發(fā)布時間：2017-05-18 01:00

  本文關(guān)鍵詞：干擾素刺激基因I6（ISG16）的克隆表達(dá)及其對丙型肝炎病毒和I型干擾素信號通路的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)引起的慢性丙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染性肝臟疾病,目前全球感染者約1.5億。感染HCV后,只有20%的感染者可以自發(fā)清除病毒,而且HCV感染造成的慢性化程度較高,是引起肝硬化、肝纖維化以及肝癌的主要原因之一。丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是聚乙二醇干擾素(pegylated-interferon, PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林(Ribavirin, RBV),但是存在療程長、費(fèi)用高、副作用大等缺陷。本課題組在前期研究中使用基因芯片技術(shù)從采用干擾素治療的丙肝患者有效和無效病人肝組織中篩選出18個差異表達(dá)基因,其中,在治療無效患者的治療前的肝穿組織中,干擾素刺激基因16(interferon-stimulated gene 16, ISG16)呈現(xiàn)高表達(dá)。ISG16是最早發(fā)現(xiàn)的能夠被Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的干擾素刺激基因之一但是ISG16對HCV復(fù)制以及Ⅰ型干擾素信號通路的影響還沒有相關(guān)研究。目的：在HCVcc體外培養(yǎng)細(xì)胞模型(Huh7.5.1細(xì)胞)和HCV復(fù)制子細(xì)胞(Conlb細(xì)胞)中高表達(dá)ISG16,研究ISG16高表達(dá)對HCV復(fù)制以及Ⅰ型干擾素抗病毒作用的影響;研究ISG16對Ⅰ型干擾素信號通路的影響；研究ISG16在經(jīng)干擾素治療后有效和無效的丙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的表達(dá)差異。最終闡明ISG16在HCV復(fù)制,干擾素抗HCV活性,Ⅰ型干擾素信號通路及HCV逃逸宿主先天免疫中的作用。方法：采用基因克隆方法構(gòu)建ISG16高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16,轉(zhuǎn)染Huh7.5.1和Con1b細(xì)胞,采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtime-PCR)檢測ISG16、HCV以及其他ISGs的表達(dá)；采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot, WB)檢測ISG16蛋白表達(dá)和P-STAT1磷酸化水平；采用雙熒光報告基因法檢測干擾素刺激反應(yīng)元件(interferon-stimulated response element, ISRE)的活性。以此探討ISG16對HCV復(fù)制、干擾素抗病毒作用以及Ⅰ型干擾素信號通路的影響。抽取經(jīng)干擾素治療后的丙型肝炎患者的靜脈血,分離得到PBMCs,體外培養(yǎng)經(jīng)Ⅰ型干擾素(IFN-a)刺激后,檢測PBMCs中ISG16的表達(dá)水平。結(jié)果：構(gòu)建的ISG16高表達(dá)質(zhì)粒,成功在Huh7.5.1和Con1b細(xì)胞中表達(dá)；ISG16高表達(dá)能夠促進(jìn)HCV復(fù)制,抑制IFN-a抗病毒作用,對Ⅰ型干擾素信號通路中的關(guān)鍵點(diǎn)具有明顯影響：延長P-STAT1的磷酸化時間,抑制ISRE活性；在丙型肝炎患者PBMCs中,治療有效和無效之間的本底表達(dá)比較發(fā)現(xiàn),治療無效者本底表達(dá)較高,但是由于樣本量較少,結(jié)果無顯著性差異,治療有效者經(jīng)IFN-α刺激后,ISG16表達(dá)升高更顯著。結(jié)論：ISG16能夠促進(jìn)HCV復(fù)制,抑制IFN-α的抗病毒作用,這種作用可能是通過影響I型干擾素信號通路中的關(guān)鍵點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的；丙肝病毒感染后導(dǎo)致ISG16表達(dá)升高,也許是HCV逃逸宿主先天免疫關(guān)鍵的分子機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 干擾素刺激基因16 Ⅰ型干擾素信號通路 外周血單核細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 前言9-17
• 1 丙型肝炎病毒研究現(xiàn)狀9-12
• 2 干擾素刺激基因1612-13
• 3 本研究的目的與意義13-14
• 4 本研究的技術(shù)路線14-17
• 實(shí)驗(yàn)材料17-26
• 1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材17-18
• 2 常用工具酶和試劑18-19
• 3 菌株及培養(yǎng)基19
• 4 細(xì)胞及培養(yǎng)基19-20
• 5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及載體20-22
• 6 Realtime PCR引物22
• 7 常用試劑配制方法22-24
• 8 主要試劑及來源用途24-26
• 實(shí)驗(yàn)方法26-44
• 第一部分 ISG16基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建26-33
• 1 ISG16基因目的片段的獲得26-29
• 2 目的片段與測序載體連接驗(yàn)證片段正確性29-31
• 3 目的片段與表達(dá)載體連接31-33
• 第二部分 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16的真核表達(dá)驗(yàn)證33-40
• 1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16大量提取33-34
• 2 細(xì)胞株復(fù)蘇和培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染體系建立34-36
• 3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16的真核表達(dá)驗(yàn)證36-40
• 第三部分 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16對丙型肝炎病毒以及干擾素信號通路的影響40-42
• 1 ISG16對丙型肝炎病毒復(fù)制以及IFN-α抗病毒作用的影響40-41
• 2 ISG16對干擾素信號通路的影響41-42
• 第四部分 ISG16在丙型肝炎病人外周血單核細(xì)胞PBMCs中的表達(dá)42-44
• 1 丙型肝炎病人外周血標(biāo)本采集42
• 2 PBMCs的分離42-43
• 3 PBMCs培養(yǎng)和處理43
• 4 總RNA提取和Realtime-PCR檢測43-44
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-52
• 1 pcDNA3.1-3×tag-ISG16質(zhì)粒構(gòu)建44-46
• 2 pcDNA3.1-3×tag-ISG16在肝癌細(xì)胞系中的高表達(dá)46-47
• 3 ISG16對HCV復(fù)制以及IFN-α抗病毒作用的影響47-48
• 4 ISG16對Ⅰ型干擾素信號通路的影響48-51
• 5 ISG16在慢性丙型肝炎患者PBMCs中的表達(dá)水平與干擾素治療療效的相關(guān)性研究51-52
• 討論52-55
• 結(jié)論55-56
• 附錄56-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 文獻(xiàn)綜述62-73
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 個人簡歷73-74
• 致謝74-75

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Ulrich Spengler;Hans Dieter Nischalke;Jacob Nattermann;Christian P Strassburg;;Between Scylla and Charybdis:The role of the human immune system in the pathogenesis of hepatitis C[J];World Journal of Gastroenterology;2013年44期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳燕妮;微小RNA（miRNA）調(diào)控乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒基因表達(dá)和復(fù)制的分子機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2011年

2 徐紹建;PCV2分子流行病學(xué)及其感染與JAK-STAT信號通路相互作用研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：干擾素刺激基因I6（ISG16）的克隆表達(dá)及其對丙型肝炎病毒和I型干擾素信號通路的影響研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374796