本文關(guān)鍵詞：氯硝柳胺對AB.9和Vero細胞毒性及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：氯硝柳胺具有殺螺效果好、對人畜毒性低的優(yōu)點,是WHO唯一推薦可以大面積使用的化學滅螺藥物,也是目前我國使用最普遍的化學滅螺藥物,在血吸蟲病防治進程中發(fā)揮了巨大的作用。但在滅螺劑量下,氯硝柳胺對魚等水生動物具有較強的急性毒性作用,在滅螺過程中,氯硝柳胺可能會流入河流、湖泊等,引起魚類、蝦、螃蟹等的死亡,造成經(jīng)濟損失,影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展,同時也影響血防工作的開展。因此,降低氯硝柳胺對魚等水生動物的毒性成為目前血防工作迫切需要解決的問題。要解決氯硝柳胺對水生動物的毒性,首先要弄清楚對魚等水生動物的毒性作用機制和作用靶點,從而為研制和開發(fā)對魚等水生動物毒性低的殺螺藥物提供理論依據(jù)。在毒性機制研究中,采用活魚進行研究,不僅周期長、成本高,而且魚類本身具有對藥物的代謝降解作用,導致結(jié)果重復性差。利用體外的魚類細胞培養(yǎng)代替活魚進行毒理的實驗,則藥物與細胞直接作用,周期短,成本低。魚類細胞的均一性好,具有遺傳相似性,避免不同體系的影響,重復性好,并且可同時進行多種藥物、多種濃度的檢測,從而獲得確切的毒理機制。因此,本研究選用斑馬魚尾鰭細胞株(AB.9)和非洲綠猴腎細胞株(Vero)2株細胞系替代整體魚進行毒性研究,研究氯硝柳胺對細胞毒性作用和影響,為闡明氯硝柳胺的毒性機制開拓新的研究途徑。一AB.9和Vero細胞株的建立與培養(yǎng)1.1細胞株的建立與培養(yǎng)購買AB.9細胞、Vero細胞,首先檢查培養(yǎng)瓶外觀,查驗細胞,確保細胞生長狀況良好,沒有污染現(xiàn)象。將AB.9細胞靜置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后,可以進行培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇,待細胞生長至對數(shù)生長期時進行毒性實驗。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示AB.9細胞在接種4h~6h貼壁,細胞完全伸展,呈不規(guī)則形態(tài)。將Vero細胞靜置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后進行傳代、凍存、復蘇,待細胞生長至對數(shù)生長期時進行毒性實驗。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示Vero細胞在接種4h~6h內(nèi)貼壁,細胞完全伸展,呈不規(guī)則形態(tài)。AB.9細胞、Vero細胞均未被污染,重新復蘇凍存的細胞株生長良好,可在實驗室保存、傳代,保種成功。1.2細胞生長曲線繪制將細胞接種于96孔板上,采用MTT法跟蹤細胞不同時段的OD值,連續(xù)對細胞進行計數(shù),繪制AB.9細胞、Vero細胞的細胞生長曲線,推算2株細胞在細胞培養(yǎng)板上的最佳接種條件。結(jié)果顯示AB.9細胞以3×104個/孔接種于96孔板,0~24h處于休眠期,24h~48h處于對數(shù)生長期,隨后進入平臺期。Vero細胞以3×103個/孔接種于96孔板,0~24h處于休眠期,24h~48h處于對數(shù)生長期,隨后進入平臺期。對數(shù)生長期的細胞活力最強,因此AB.9細胞以3×104~6×104個/孔接種于96孔板,或5×105個/孔接種于6孔板,24h~48h加入氯硝柳胺進行檢測最合適。Vero細胞以3×103~6×103個/孔接種于96孔板,或5×104個/孔接種于6孔板,24h~48h加入氯硝柳胺進行檢測最合適。二氯硝柳胺對AB.9和Vero細胞的毒性測定2.1氯硝柳胺對AB.9細胞毒性觀察AB.9活細胞數(shù)量為5×105個/孔接種于6孔板,28℃下靜置培養(yǎng)24h。配制氯硝柳胺濃度為6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008mg/L的培養(yǎng)基,1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。顯微鏡下觀察氯硝柳胺作用AB.9細胞的形態(tài)學變化并紀錄,測定氯硝柳胺對AB.9的細胞毒性。結(jié)果顯示氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)AB.9細胞24h,隨著氯硝柳胺濃度的升高,細胞間隙從緊密逐漸變大,細胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則并逐漸皺縮變成圓形。當氯硝柳胺濃度2mg/L時,細胞幾乎全部變圓,且大部分細胞呈現(xiàn)空泡狀,周圍可見有細胞碎片。氯硝柳胺對AB.9細胞具有毒性,且隨著劑量的增加毒性加強,最大耐受濃度約為2 mg/L。2.2氯硝柳胺對Vero細胞毒性觀察Vero活細胞數(shù)量為5×104個/孔接種于6孔板,37℃,5%CO2下靜置培養(yǎng)24h。將原培養(yǎng)基吸去,PBS清洗3遍。分別添加氯硝柳胺濃度為20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培養(yǎng)基溶液,并以1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。顯微鏡下觀察氯硝柳胺作用Vero細胞形態(tài)變化并紀錄,測定氯硝柳胺對Vero的細胞毒性。結(jié)果顯示氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細胞24h,與陰性對照相比Vero細胞形態(tài)不隨氯硝柳胺濃度的改變而變化,表明氯硝柳胺對Vero細胞無明顯毒性反應。2.3 MTT法檢測氯硝柳胺對AB.9細胞毒性AB.9活細胞數(shù)量為5×104個/孔接種于96孔板,重復接種2塊96孔板,細胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008 mg/L的培養(yǎng)基,每個濃度設(shè)置3個復孔。以1%DMSO的無血清RMPI1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h,經(jīng)MTT法處理后酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長為測定其光吸收值。不同時間不同濃度的氯硝柳胺作用AB.9細胞,對細胞存活率的影響,得到氯硝柳胺對細胞的毒性劑量-效應關(guān)系。MTT法計算細胞的體外存活率的計算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示AB.9細胞經(jīng)氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng),MTT檢測到在培養(yǎng)基中氯硝柳胺濃度≤0.070 mg/L時,24h和48h組細胞的存活率高于空白對照組,且隨著藥物濃度的升高,細胞的增值率增加,促進細胞生長。氯硝柳胺的濃度0.070 mg/L時,隨著藥物濃度的升高,與空白對照組細胞相比存活率下降,死亡率升高。將藥物濃度與細胞生存率進行曲線擬合,計算得到氯硝柳胺對AB.9細胞24h和48h的IC50值分別為0.485 mg/L和0.358mg/L,R2分別為0.953和0.995。氯硝柳胺對細胞的影響隨著濃度的逐漸升高,從刺激生長轉(zhuǎn)變?yōu)橐种粕L,再轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸺毎劳�。氯硝柳胺對細胞產(chǎn)生急性毒性,魚細胞和魚的致死閾值濃度接近,因此氯硝柳胺對AB.9細胞的毒性測定,可以作為藥物毒性檢測的新方法,也為用細胞代替整體生物測定提供了科學依據(jù)。2.4 MTT法檢測氯硝柳胺對Vero細胞毒性Vero活細胞數(shù)量為5×103個/孔接種于96孔板,重復接種2塊96孔板,細胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培養(yǎng)基溶液,每個濃度設(shè)置3個復孔。以1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h,經(jīng)MTT法處理后酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值,MTT法計算細胞的體外存活率的計算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示Vero細胞經(jīng)不同濃度氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h和48h,MTT法檢測得各組與空白對照組的細胞存活率相比無明顯差異。Vero細胞在20 mg/L時存活率未發(fā)生明顯變化,未發(fā)現(xiàn)Vero細胞的生長受氯硝柳胺的明顯影響。2.5 SRB法檢測氯硝柳胺對AB.9細胞毒性AB.9活細胞數(shù)量為5×104個/孔接種于96孔板,重復接種2塊96孔板,細胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008 mg/L的培養(yǎng)基,每個濃度設(shè)置3個復孔。1%DMSO的無血清RMPI1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h,經(jīng)SRB法處理,酶聯(lián)免疫檢測儀在波長540 nm處測定其吸光值。不同時間不同濃度的氯硝柳胺作用AB.9細胞,對細胞存活率的影響,得到氯硝柳胺對細胞的毒性劑量-效應關(guān)系。計算細胞的體外存活率的計算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示AB.9細胞經(jīng)氯硝柳胺培養(yǎng)基培養(yǎng),在培養(yǎng)基中氯硝柳胺濃度≤0.070 mg/L時,24h和48h組細胞的存活率高于空白對照組,且隨著藥物濃度的升高,細胞的增值率增加,促進細胞生長。氯硝柳胺的濃度0.070 mg/L時,隨著藥物濃度的升高,與空白對照組相比,細胞的存活率下降,死亡率升高,抑制細胞生長。將藥物濃度與細胞生存率進行曲線擬合,計算得到氯硝柳胺對AB.9細胞24h和48h的IC50值分別為0.298mg/L和0.318 mg/L,R2分別為0.985和0.968。氯硝柳胺對細胞生長的影響,從刺激生長轉(zhuǎn)變?yōu)橐种粕L,再轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸺毎劳觥Ｂ认趿穼︳~細胞和魚的致死閾值濃度接近,為用魚細胞代替整體動物(魚)研究氯硝柳胺的細胞毒性機制提供了科學依據(jù)。2.6 SRB法檢測氯硝柳胺對Vero細胞毒性Vero活細胞數(shù)量為5×103個/孔接種于96孔板,重復接種2塊96孔板,細胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培養(yǎng)基溶液,每個濃度設(shè)置3個復孔。1%DMSO的無血清RMPI1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h后,經(jīng)SRB法處理,酶聯(lián)免疫檢測儀在波長540 nm處測定其吸光值。SRB法計算細胞的體外存活率的計算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示Vero細胞經(jīng)氯硝柳胺培養(yǎng)基培養(yǎng),SRB法檢測各組與空白對照組的細胞存活率無明顯差異。在氯硝柳胺濃度為20 mg/L時,Vero細胞存活率未發(fā)生明顯變化其生長不受氯硝柳胺的明顯影響。三氯硝柳胺引起AB.9細胞死亡的機制研究3.1 Annexin V/PI法檢測氯硝柳胺對AB.9細胞死亡的影響AB.9的活細胞數(shù)量為5×105個/孔,接種于6孔板中,細胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為0.070mg/L、0.200mg/L、0.300mg/L、0.400mg/L、0.500mg/L、0.600mg/L的培養(yǎng)基,1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基視為溶劑對照,無血清的1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。加入凋亡誘導藥物的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為陽性對照。28℃下靜置培養(yǎng)24 h。Annexin V/PI法處理,流式細胞儀檢測Annexin V、PI、Annexin V和PI 3種熒光水平,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計算細胞凋亡與壞死率。結(jié)果顯示AB.9細胞經(jīng)氯硝柳胺培養(yǎng)基作用24h,當藥物濃度0.070 mg/L時,隨著藥物濃度的增加,活細胞數(shù)量逐漸減少,細胞的壞死率逐漸上升,而凋亡率則沒有明顯變化。說明氯硝柳胺能引起魚細胞壞死,并且其在細胞的作用位點可能位于啟動細胞壞死的表達通路或線粒體中細胞呼吸鏈的組成蛋白。3.2 Annexin V/PI法檢測氯硝柳胺對Vero細胞死亡的影響Vero的活細胞數(shù)量為5×104個/孔,接種于6孔板中。經(jīng)氯硝柳胺濃度為5 mg/L和20 mg/L分別作用的Vero細胞為實驗組。1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。加入凋亡誘導藥物的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為陽性對照。37℃,5%CO2下靜置培養(yǎng)24 h。Annexin V/PI法處理,流式細胞儀檢測Annexin V、PI、Annexin V和PI 3種熒光水平,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計算細胞凋亡與壞死率。結(jié)果顯示Vero細胞經(jīng)氯硝柳胺濃度5 mg/L和20 mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng),細胞壞死率、凋亡率與陰性對照組相比較無明顯差異(P0.05)。說明氯硝柳胺對Vero細胞死亡方式無明顯作用。四氯硝柳胺對AB.9細胞蛋白表達的影響研究不同濃度氯硝柳胺作用AB.9細胞24 h,氯硝柳胺濃度為0.500 mg/L、0.070 mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)的AB.9細胞為實驗組,1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。24h后各實驗組細胞用裂解液裂解,純化蛋白質(zhì),Brandford法進行定量,確保各組的待檢測蛋白含量基本一致。用上樣緩沖液溶解蛋白樣品,進行第一向等電聚焦電泳(IEF)。IEF結(jié)束后,進行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將凝膠進行考馬斯亮藍染色,通過Gel Doc 2000凝膠成像儀采集圖像,利用PDQuest 8.0凝膠分析軟件對圖像進行分析,篩選出表達有差異的蛋白點。將表達有差異的蛋白切下,提取凝膠上的蛋白進行時間飛行質(zhì)譜鑒定,同時結(jié)合生物信息學進行生物學功能鑒定。利用PDQuest8.0電泳圖譜分析軟件檢測不同濃度氯硝柳胺作用的AB.9細胞蛋白電泳圖譜上的蛋白點。每個濃度的蛋白樣品進行3次平行電泳,同一種樣品蛋白圖譜比對顯示重復性在77%~100%之間,樣品重復性很好,滿足各處理組樣品間進行差異比較的要求�？瞻讓φ战M、溶劑對照組、0.070 mg/L、0.500 mg/L分別檢測出193±44、115±22、102±18.7、83±25個蛋白點,其中大部分蛋白的分子量處于10KD~120KD分布范圍內(nèi),蛋白的等電點在5~8之間。AB.9細胞蛋白電泳圖譜分別進行兩兩比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺濃度為0.070 mg/L組,與空白對照相比,有26個差異點,其中有2個蛋白點表達上調(diào),有12個蛋白點只在空白對照中表達,有12個蛋白點只在0.070 mg/L氯硝柳胺作用后表達。在氯硝柳胺濃度為0.500 mg/L組,與空白對照相比,有34個差異點,其中有3個蛋白點表達上調(diào),5個蛋白點表達下調(diào),有13個蛋白點只在空白對照中表達,有13個蛋白點只在0.500 mg/L氯硝柳胺作用后表達。挑選部分差異點進行飛行時間質(zhì)譜鑒定,成功鑒定得到7個蛋白,為:DNA-dirceted RNA polymeraseⅢsubunit RPC2、ch211-69g19.2 protein、88517 protein、PREDICTED:insulin receptor substrate 2、M-phase phosphoprotein 6、novel protein、fructose-bisphosphate aldolase C-B。經(jīng)生物功能鑒定7個蛋白分別與信號轉(zhuǎn)導、細胞分裂、細胞生長、細胞內(nèi)糖酵解途徑有關(guān),具體功能和作用有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：氯硝柳胺 斑馬魚尾鰭細胞株(AB.9) 非洲綠猴腎細胞株(Vero) 細胞毒性
【學位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R184.38;R532.21
【目錄】：

• 中文摘要7-15
• 英文摘要15-26
• 前言26-30
• 第一章 AB.9 和Vero細胞株的建立與培養(yǎng)30-46
• 材料和方法31-41
• 結(jié)果41-44
• 討論44-46
• 第二章 氯硝柳胺對AB.9 和Vero細胞的毒性測定46-74
• 材料和方法46-55
• 結(jié)果55-72
• 結(jié)論72-74
• 第三章 氯硝柳胺引起AB.9 細胞死亡的機制研究74-85
• 材料和方法74-80
• 結(jié)果80-84
• 結(jié)論84-85
• 第四章 氯硝柳胺對AB.9 細胞蛋白表達的影響研究85-110
• 材料和方法86-97
• 結(jié)果97-107
• 結(jié)論107-110
• 全文結(jié)論110-112
• 參考文獻112-117
• 文獻綜述117-122
• 參考文獻120-122
• 碩士期間參與發(fā)表論文及參與課題122-142
• 致謝142-143

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭維;吳勇權(quán);許麗榮;鄭綠茵;范小林;;聚乙二醇基氯硝柳胺衍生物體外抑制釘螺乙酰膽堿酯酶活性的研究[J];化學試劑;2009年11期

  本文關(guān)鍵詞：氯硝柳胺對AB.9和Vero細胞毒性及其機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374563