發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 22:04

  本文關(guān)鍵詞：氯硝柳胺對AB.9和Vero細(xì)胞毒性及其機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：氯硝柳胺具有殺螺效果好、對人畜毒性低的優(yōu)點(diǎn),是WHO唯一推薦可以大面積使用的化學(xué)滅螺藥物,也是目前我國使用最普遍的化學(xué)滅螺藥物,在血吸蟲病防治進(jìn)程中發(fā)揮了巨大的作用。但在滅螺劑量下,氯硝柳胺對魚等水生動(dòng)物具有較強(qiáng)的急性毒性作用,在滅螺過程中,氯硝柳胺可能會(huì)流入河流、湖泊等,引起魚類、蝦、螃蟹等的死亡,造成經(jīng)濟(jì)損失,影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展,同時(shí)也影響血防工作的開展。因此,降低氯硝柳胺對魚等水生動(dòng)物的毒性成為目前血防工作迫切需要解決的問題。要解決氯硝柳胺對水生動(dòng)物的毒性,首先要弄清楚對魚等水生動(dòng)物的毒性作用機(jī)制和作用靶點(diǎn),從而為研制和開發(fā)對魚等水生動(dòng)物毒性低的殺螺藥物提供理論依據(jù)。在毒性機(jī)制研究中,采用活魚進(jìn)行研究,不僅周期長、成本高,而且魚類本身具有對藥物的代謝降解作用,導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差。利用體外的魚類細(xì)胞培養(yǎng)代替活魚進(jìn)行毒理的實(shí)驗(yàn),則藥物與細(xì)胞直接作用,周期短,成本低。魚類細(xì)胞的均一性好,具有遺傳相似性,避免不同體系的影響,重復(fù)性好,并且可同時(shí)進(jìn)行多種藥物、多種濃度的檢測,從而獲得確切的毒理機(jī)制。因此,本研究選用斑馬魚尾鰭細(xì)胞株(AB.9)和非洲綠猴腎細(xì)胞株(Vero)2株細(xì)胞系替代整體魚進(jìn)行毒性研究,研究氯硝柳胺對細(xì)胞毒性作用和影響,為闡明氯硝柳胺的毒性機(jī)制開拓新的研究途徑。一AB.9和Vero細(xì)胞株的建立與培養(yǎng)1.1細(xì)胞株的建立與培養(yǎng)購買AB.9細(xì)胞、Vero細(xì)胞,首先檢查培養(yǎng)瓶外觀,查驗(yàn)細(xì)胞,確保細(xì)胞生長狀況良好,沒有污染現(xiàn)象。將AB.9細(xì)胞靜置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后,可以進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇,待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示AB.9細(xì)胞在接種4h~6h貼壁,細(xì)胞完全伸展,呈不規(guī)則形態(tài)。將Vero細(xì)胞靜置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后進(jìn)行傳代、凍存、復(fù)蘇,待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示Vero細(xì)胞在接種4h~6h內(nèi)貼壁,細(xì)胞完全伸展,呈不規(guī)則形態(tài)。AB.9細(xì)胞、Vero細(xì)胞均未被污染,重新復(fù)蘇凍存的細(xì)胞株生長良好,可在實(shí)驗(yàn)室保存、傳代,保種成功。1.2細(xì)胞生長曲線繪制將細(xì)胞接種于96孔板上,采用MTT法跟蹤細(xì)胞不同時(shí)段的OD值,連續(xù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),繪制AB.9細(xì)胞、Vero細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線,推算2株細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上的最佳接種條件。結(jié)果顯示AB.9細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種于96孔板,0~24h處于休眠期,24h~48h處于對數(shù)生長期,隨后進(jìn)入平臺(tái)期。Vero細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板,0~24h處于休眠期,24h~48h處于對數(shù)生長期,隨后進(jìn)入平臺(tái)期。對數(shù)生長期的細(xì)胞活力最強(qiáng),因此AB.9細(xì)胞以3×104~6×104個(gè)/孔接種于96孔板,或5×105個(gè)/孔接種于6孔板,24h~48h加入氯硝柳胺進(jìn)行檢測最合適。Vero細(xì)胞以3×103~6×103個(gè)/孔接種于96孔板,或5×104個(gè)/孔接種于6孔板,24h~48h加入氯硝柳胺進(jìn)行檢測最合適。二氯硝柳胺對AB.9和Vero細(xì)胞的毒性測定2.1氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞毒性觀察AB.9活細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)/孔接種于6孔板,28℃下靜置培養(yǎng)24h。配制氯硝柳胺濃度為6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008mg/L的培養(yǎng)基,1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。顯微鏡下觀察氯硝柳胺作用AB.9細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并紀(jì)錄,測定氯硝柳胺對AB.9的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)AB.9細(xì)胞24h,隨著氯硝柳胺濃度的升高,細(xì)胞間隙從緊密逐漸變大,細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則并逐漸皺縮變成圓形。當(dāng)氯硝柳胺濃度2mg/L時(shí),細(xì)胞幾乎全部變圓,且大部分細(xì)胞呈現(xiàn)空泡狀,周圍可見有細(xì)胞碎片。氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞具有毒性,且隨著劑量的增加毒性加強(qiáng),最大耐受濃度約為2 mg/L。2.2氯硝柳胺對Vero細(xì)胞毒性觀察Vero活細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔接種于6孔板,37℃,5%CO2下靜置培養(yǎng)24h。將原培養(yǎng)基吸去,PBS清洗3遍。分別添加氯硝柳胺濃度為20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培養(yǎng)基溶液,并以1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。顯微鏡下觀察氯硝柳胺作用Vero細(xì)胞形態(tài)變化并紀(jì)錄,測定氯硝柳胺對Vero的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞24h,與陰性對照相比Vero細(xì)胞形態(tài)不隨氯硝柳胺濃度的改變而變化,表明氯硝柳胺對Vero細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)。2.3 MTT法檢測氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞毒性AB.9活細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔接種于96孔板,重復(fù)接種2塊96孔板,細(xì)胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008 mg/L的培養(yǎng)基,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以1%DMSO的無血清RMPI1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h,經(jīng)MTT法處理后酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長為測定其光吸收值。不同時(shí)間不同濃度的氯硝柳胺作用AB.9細(xì)胞,對細(xì)胞存活率的影響,得到氯硝柳胺對細(xì)胞的毒性劑量-效應(yīng)關(guān)系。MTT法計(jì)算細(xì)胞的體外存活率的計(jì)算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細(xì)胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示AB.9細(xì)胞經(jīng)氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng),MTT檢測到在培養(yǎng)基中氯硝柳胺濃度≤0.070 mg/L時(shí),24h和48h組細(xì)胞的存活率高于空白對照組,且隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞的增值率增加,促進(jìn)細(xì)胞生長。氯硝柳胺的濃度0.070 mg/L時(shí),隨著藥物濃度的升高,與空白對照組細(xì)胞相比存活率下降,死亡率升高。將藥物濃度與細(xì)胞生存率進(jìn)行曲線擬合,計(jì)算得到氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞24h和48h的IC50值分別為0.485 mg/L和0.358mg/L,R2分別為0.953和0.995。氯硝柳胺對細(xì)胞的影響隨著濃度的逐漸升高,從刺激生長轉(zhuǎn)變?yōu)橐种粕L,再轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸺?xì)胞死亡。氯硝柳胺對細(xì)胞產(chǎn)生急性毒性,魚細(xì)胞和魚的致死閾值濃度接近,因此氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞的毒性測定,可以作為藥物毒性檢測的新方法,也為用細(xì)胞代替整體生物測定提供了科學(xué)依據(jù)。2.4 MTT法檢測氯硝柳胺對Vero細(xì)胞毒性Vero活細(xì)胞數(shù)量為5×103個(gè)/孔接種于96孔板,重復(fù)接種2塊96孔板,細(xì)胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培養(yǎng)基溶液,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h,經(jīng)MTT法處理后酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值,MTT法計(jì)算細(xì)胞的體外存活率的計(jì)算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細(xì)胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示Vero細(xì)胞經(jīng)不同濃度氯硝柳胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h和48h,MTT法檢測得各組與空白對照組的細(xì)胞存活率相比無明顯差異。Vero細(xì)胞在20 mg/L時(shí)存活率未發(fā)生明顯變化,未發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞的生長受氯硝柳胺的明顯影響。2.5 SRB法檢測氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞毒性AB.9活細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔接種于96孔板,重復(fù)接種2塊96孔板,細(xì)胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008 mg/L的培養(yǎng)基,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。1%DMSO的無血清RMPI1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h,經(jīng)SRB法處理,酶聯(lián)免疫檢測儀在波長540 nm處測定其吸光值。不同時(shí)間不同濃度的氯硝柳胺作用AB.9細(xì)胞,對細(xì)胞存活率的影響,得到氯硝柳胺對細(xì)胞的毒性劑量-效應(yīng)關(guān)系。計(jì)算細(xì)胞的體外存活率的計(jì)算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細(xì)胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示AB.9細(xì)胞經(jīng)氯硝柳胺培養(yǎng)基培養(yǎng),在培養(yǎng)基中氯硝柳胺濃度≤0.070 mg/L時(shí),24h和48h組細(xì)胞的存活率高于空白對照組,且隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞的增值率增加,促進(jìn)細(xì)胞生長。氯硝柳胺的濃度0.070 mg/L時(shí),隨著藥物濃度的升高,與空白對照組相比,細(xì)胞的存活率下降,死亡率升高,抑制細(xì)胞生長。將藥物濃度與細(xì)胞生存率進(jìn)行曲線擬合,計(jì)算得到氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞24h和48h的IC50值分別為0.298mg/L和0.318 mg/L,R2分別為0.985和0.968。氯硝柳胺對細(xì)胞生長的影響,從刺激生長轉(zhuǎn)變?yōu)橐种粕L,再轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸺?xì)胞死亡。氯硝柳胺對魚細(xì)胞和魚的致死閾值濃度接近,為用魚細(xì)胞代替整體動(dòng)物(魚)研究氯硝柳胺的細(xì)胞毒性機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。2.6 SRB法檢測氯硝柳胺對Vero細(xì)胞毒性Vero活細(xì)胞數(shù)量為5×103個(gè)/孔接種于96孔板,重復(fù)接種2塊96孔板,細(xì)胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培養(yǎng)基溶液,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。1%DMSO的無血清RMPI1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。分別靜置培養(yǎng)24h和48h后,經(jīng)SRB法處理,酶聯(lián)免疫檢測儀在波長540 nm處測定其吸光值。SRB法計(jì)算細(xì)胞的體外存活率的計(jì)算公式如下:存活率=用藥孔值無藥細(xì)胞對照孔值×100%。結(jié)果顯示Vero細(xì)胞經(jīng)氯硝柳胺培養(yǎng)基培養(yǎng),SRB法檢測各組與空白對照組的細(xì)胞存活率無明顯差異。在氯硝柳胺濃度為20 mg/L時(shí),Vero細(xì)胞存活率未發(fā)生明顯變化其生長不受氯硝柳胺的明顯影響。三氯硝柳胺引起AB.9細(xì)胞死亡的機(jī)制研究3.1 Annexin V/PI法檢測氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞死亡的影響AB.9的活細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)/孔,接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后,分別添加氯硝柳胺濃度為0.070mg/L、0.200mg/L、0.300mg/L、0.400mg/L、0.500mg/L、0.600mg/L的培養(yǎng)基,1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基視為溶劑對照,無血清的1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。加入凋亡誘導(dǎo)藥物的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為陽性對照。28℃下靜置培養(yǎng)24 h。Annexin V/PI法處理,流式細(xì)胞儀檢測Annexin V、PI、Annexin V和PI 3種熒光水平,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞凋亡與壞死率。結(jié)果顯示AB.9細(xì)胞經(jīng)氯硝柳胺培養(yǎng)基作用24h,當(dāng)藥物濃度0.070 mg/L時(shí),隨著藥物濃度的增加,活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,細(xì)胞的壞死率逐漸上升,而凋亡率則沒有明顯變化。說明氯硝柳胺能引起魚細(xì)胞壞死,并且其在細(xì)胞的作用位點(diǎn)可能位于啟動(dòng)細(xì)胞壞死的表達(dá)通路或線粒體中細(xì)胞呼吸鏈的組成蛋白。3.2 Annexin V/PI法檢測氯硝柳胺對Vero細(xì)胞死亡的影響Vero的活細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔,接種于6孔板中。經(jīng)氯硝柳胺濃度為5 mg/L和20 mg/L分別作用的Vero細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。加入凋亡誘導(dǎo)藥物的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為陽性對照。37℃,5%CO2下靜置培養(yǎng)24 h。Annexin V/PI法處理,流式細(xì)胞儀檢測Annexin V、PI、Annexin V和PI 3種熒光水平,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞凋亡與壞死率。結(jié)果顯示Vero細(xì)胞經(jīng)氯硝柳胺濃度5 mg/L和20 mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞壞死率、凋亡率與陰性對照組相比較無明顯差異(P0.05)。說明氯硝柳胺對Vero細(xì)胞死亡方式無明顯作用。四氯硝柳胺對AB.9細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響研究不同濃度氯硝柳胺作用AB.9細(xì)胞24 h,氯硝柳胺濃度為0.500 mg/L、0.070 mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)的AB.9細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,1%DMSO的無血清RMPI 1640培養(yǎng)基為溶劑對照,無血清的RMPI 1640培養(yǎng)基為陰性對照,新的10%小牛血清的培養(yǎng)基為空白對照。24h后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用裂解液裂解,純化蛋白質(zhì),Brandford法進(jìn)行定量,確保各組的待檢測蛋白含量基本一致。用上樣緩沖液溶解蛋白樣品,進(jìn)行第一向等電聚焦電泳(IEF)。IEF結(jié)束后,進(jìn)行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,通過Gel Doc 2000凝膠成像儀采集圖像,利用PDQuest 8.0凝膠分析軟件對圖像進(jìn)行分析,篩選出表達(dá)有差異的蛋白點(diǎn)。將表達(dá)有差異的蛋白切下,提取凝膠上的蛋白進(jìn)行時(shí)間飛行質(zhì)譜鑒定,同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行生物學(xué)功能鑒定。利用PDQuest8.0電泳圖譜分析軟件檢測不同濃度氯硝柳胺作用的AB.9細(xì)胞蛋白電泳圖譜上的蛋白點(diǎn)。每個(gè)濃度的蛋白樣品進(jìn)行3次平行電泳,同一種樣品蛋白圖譜比對顯示重復(fù)性在77%~100%之間,樣品重復(fù)性很好,滿足各處理組樣品間進(jìn)行差異比較的要求�？瞻讓φ战M、溶劑對照組、0.070 mg/L、0.500 mg/L分別檢測出193±44、115±22、102±18.7、83±25個(gè)蛋白點(diǎn),其中大部分蛋白的分子量處于10KD~120KD分布范圍內(nèi),蛋白的等電點(diǎn)在5~8之間。AB.9細(xì)胞蛋白電泳圖譜分別進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺濃度為0.070 mg/L組,與空白對照相比,有26個(gè)差異點(diǎn),其中有2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),有12個(gè)蛋白點(diǎn)只在空白對照中表達(dá),有12個(gè)蛋白點(diǎn)只在0.070 mg/L氯硝柳胺作用后表達(dá)。在氯硝柳胺濃度為0.500 mg/L組,與空白對照相比,有34個(gè)差異點(diǎn),其中有3個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),5個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào),有13個(gè)蛋白點(diǎn)只在空白對照中表達(dá),有13個(gè)蛋白點(diǎn)只在0.500 mg/L氯硝柳胺作用后表達(dá)。挑選部分差異點(diǎn)進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定,成功鑒定得到7個(gè)蛋白,為:DNA-dirceted RNA polymeraseⅢsubunit RPC2、ch211-69g19.2 protein、88517 protein、PREDICTED:insulin receptor substrate 2、M-phase phosphoprotein 6、novel protein、fructose-bisphosphate aldolase C-B。經(jīng)生物功能鑒定7個(gè)蛋白分別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長、細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑有關(guān),具體功能和作用有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：氯硝柳胺 斑馬魚尾鰭細(xì)胞株(AB.9) 非洲綠猴腎細(xì)胞株(Vero) 細(xì)胞毒性
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R184.38;R532.21
【目錄】：

• 中文摘要7-15
• 英文摘要15-26
• 前言26-30
• 第一章 AB.9 和Vero細(xì)胞株的建立與培養(yǎng)30-46
• 材料和方法31-41
• 結(jié)果41-44
• 討論44-46
• 第二章 氯硝柳胺對AB.9 和Vero細(xì)胞的毒性測定46-74
• 材料和方法46-55
• 結(jié)果55-72
• 結(jié)論72-74
• 第三章 氯硝柳胺引起AB.9 細(xì)胞死亡的機(jī)制研究74-85
• 材料和方法74-80
• 結(jié)果80-84
• 結(jié)論84-85
• 第四章 氯硝柳胺對AB.9 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響研究85-110
• 材料和方法86-97
• 結(jié)果97-107
• 結(jié)論107-110
• 全文結(jié)論110-112
• 參考文獻(xiàn)112-117
• 文獻(xiàn)綜述117-122
• 參考文獻(xiàn)120-122
• 碩士期間參與發(fā)表論文及參與課題122-142
• 致謝142-143

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭維;吳勇權(quán);許麗榮;鄭綠茵;范小林;;聚乙二醇基氯硝柳胺衍生物體外抑制釘螺乙酰膽堿酯酶活性的研究[J];化學(xué)試劑;2009年11期

  本文關(guān)鍵詞：氯硝柳胺對AB.9和Vero細(xì)胞毒性及其機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：374563