本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體粘附素Tp0751重組菌影制備與免疫活性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]構(gòu)建重組梅毒螺旋體(Tp)黏附素Tp0751的大腸埃希菌菌影(EBG)(r Tp0751-EBG),檢測(cè)其免疫活性,為深入探討其在抗Tp感染中的潛在免疫保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。[方法](1)EBG的制備與鑒定:將含有噬菌體PHi X174裂解基因E的質(zhì)粒p HH43轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α,溫控誘導(dǎo)使其形成BG并計(jì)算裂解效率,瓊脂糖DNA電泳和透射電鏡(TEM)鑒定。(2)膜錨定載體的構(gòu)建與表達(dá):PCR擴(kuò)增膜錨定基因E'(含linker),與p ET28a-Tp0751構(gòu)建膜錨定載體p ET28a-E'-Tp0751,轉(zhuǎn)化E.coli BL21誘導(dǎo)表達(dá),WB鑒定E'-Tp0751的表達(dá)。(3)r Tp0751-EBG表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將含裂解基因盒E-box的p HH43與p ET-32a質(zhì)粒酶切、連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32a-E-box,再將其p ET28a-E'-Tp0751構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a-E'-Tp0751-E-box。(4)r Tp0751-EBG表達(dá)與鑒定:將p ET28a-E'-Tp0751-E-box轉(zhuǎn)化E.coli BL21,28℃誘導(dǎo)表達(dá)Tp0751,升溫至42℃熱誘導(dǎo)裂解,計(jì)算裂解率。WB鑒定Tp0751的表達(dá);TEM鑒定BG。(5)動(dòng)物免疫:分別用r Tp0751-EBG肌注、r Tp0751-EBG鼻滴、r Tp0751肌注(加弗氏佐劑)、EBG肌注及PBS肌注途徑免疫C57BL/6小鼠3次。每次免疫前及末次免疫后第10d收集血清和生殖道灌洗液,末次免疫后第10d制備小鼠脾細(xì)胞。(6)r Tp0751-EBG免疫活性測(cè)定:用間接ELISA法檢測(cè)血清特異性抗體Ig G抗體及生殖道灌洗液中s Ig A抗體水平,CCK-8法檢測(cè)r Tp0751刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,間接ELISA檢測(cè)IFN-γ表達(dá)水平。[結(jié)果](1)EBG制備與鑒定:42℃下p HH43上E基因被激活導(dǎo)致E.coli裂解形成BG,裂解率可達(dá)98.13%;瓊脂糖凝膠電泳未觀察到DNA條帶,TEM顯示絕大部分細(xì)菌都裂解成空泡狀并保持細(xì)菌基本形態(tài)。(2)膜錨定載體的構(gòu)建與表達(dá):PCR擴(kuò)增出大小約為180 bp左右的片段,與膜錨定基因E'一致;SDS-PAGE顯示一分子量約28KDa的可溶性蛋白,WB顯示該蛋白僅與Tp感染兔血清反應(yīng)。(3)r Tp0751-EBG表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定:酶切及測(cè)序結(jié)果表明含有目的基因Tp0751和裂解基因盒E-box的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)28℃誘導(dǎo)表達(dá)一分子量約28 KDa大小的明顯條帶,WB顯示其僅與Tp感染兔血清反應(yīng)。在42℃誘導(dǎo)重組BG的OD600值開(kāi)始下降,裂解率為96.37%。TEM鑒定結(jié)果與EBG結(jié)果類(lèi)似。(4)r Tp0751-EBG誘導(dǎo)系統(tǒng)和黏膜體液免疫應(yīng)答水平:r Tp0751-EBG肌注組、r Tp0751-EBG鼻滴組和r Tp0751肌注組小鼠血清特異性Ig G水平隨免疫次數(shù)增加而增加,第4周達(dá)到最大值,抗體效價(jià)均高于1，

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