研究旨在建立穩(wěn)定表達HBcAg的P815/c細胞株,為評價針對HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供體外感染的細胞模型。通過構建攜帶HBcAg基因的慢病毒表達載體質(zhì)粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,載體質(zhì)粒攜帯有加強型綠色熒光蛋白（eGFP）及嘌呤霉素（Puromycin）抗性標記基因,與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2以及包膜質(zhì)粒pLP/VSVG共轉染人胚腎293T細胞進行包裝,得到攜帯有HBcAg基因的重組慢病毒顆粒LV-HBcAg-Puro。經(jīng)純化、鑒定后轉染小鼠肥大瘤細胞株P815細胞72h后,通過加入并維持2μg/mL的嘌呤霉素殺死未被有效感染的細胞,藥物篩選約10 d后,免疫熒光及流式細胞儀檢測表達GFP的細胞比例在98%以上,Western Blot可檢測到轉染后細胞內(nèi)HBcAg的蛋白表達。成功構建穩(wěn)定表達HBcAg基因的細胞株P815/C,為研究小鼠體內(nèi)針對HBcAg的疫苗誘發(fā)的CTL反應提供了細胞殺傷實驗的靶細胞。 

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 細胞、菌株與質(zhì)粒
        1.1.2 主要儀器及試劑
    1.2 方法
        1.2.1 引物設計
        1.2.2 HBc Ag基因片段的擴增
        1.2.3 攜帶HBc Ag基因的p Lenti-Ubc-HBc Ag-EG-FP-3FLAG-IRES-Puro表達載體質(zhì)粒的構建
        1.2.4 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro的包裝
        1.2.5 慢病毒滴度測定
        1.2.6 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro轉染P815細胞及P815/c穩(wěn)定株篩選
2 結果
    2.1 HBc Ag目的基因的擴增結果
    2.2 重組克隆的菌落PCR鑒定結果
    2.3 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro的滴度測定
    2.4 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro轉染P815細胞的GFP表達檢測
    2.5 Western blot檢測穩(wěn)定轉染P815細胞的HB-c Ag蛋白表達
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]強制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因表達質(zhì)粒的構建[J]. 沈楠,余永勝,奚敏,潘慶春,陳小華,臧國慶,湯正好.  中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志. 2010(05)



本文編號：3664375