研究旨在建立穩(wěn)定表達(dá)HBcAg的P815/c細(xì)胞株,為評價針對HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供體外感染的細(xì)胞模型。通過構(gòu)建攜帶HBcAg基因的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,載體質(zhì)粒攜帯有加強型綠色熒光蛋白（eGFP）及嘌呤霉素（Puromycin）抗性標(biāo)記基因,與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2以及包膜質(zhì)粒pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞進(jìn)行包裝,得到攜帯有HBcAg基因的重組慢病毒顆粒LV-HBcAg-Puro。經(jīng)純化、鑒定后轉(zhuǎn)染小鼠肥大瘤細(xì)胞株P(guān)815細(xì)胞72h后,通過加入并維持2μg/mL的嘌呤霉素殺死未被有效感染的細(xì)胞,藥物篩選約10 d后,免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)GFP的細(xì)胞比例在98%以上,Western Blot可檢測到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HBcAg的蛋白表達(dá)。成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBcAg基因的細(xì)胞株P(guān)815/C,為研究小鼠體內(nèi)針對HBcAg的疫苗誘發(fā)的CTL反應(yīng)提供了細(xì)胞殺傷實驗的靶細(xì)胞。 

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒
        1.1.2 主要儀器及試劑
    1.2 方法
        1.2.1 引物設(shè)計
        1.2.2 HBc Ag基因片段的擴(kuò)增
        1.2.3 攜帶HBc Ag基因的p Lenti-Ubc-HBc Ag-EG-FP-3FLAG-IRES-Puro表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.4 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro的包裝
        1.2.5 慢病毒滴度測定
        1.2.6 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro轉(zhuǎn)染P815細(xì)胞及P815/c穩(wěn)定株篩選
2 結(jié)果
    2.1 HBc Ag目的基因的擴(kuò)增結(jié)果
    2.2 重組克隆的菌落PCR鑒定結(jié)果
    2.3 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro的滴度測定
    2.4 重組慢病毒LV-HBc Ag-Puro轉(zhuǎn)染P815細(xì)胞的GFP表達(dá)檢測
    2.5 Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P815細(xì)胞的HB-c Ag蛋白表達(dá)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]強制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[J]. 沈楠,余永勝,奚敏,潘慶春,陳小華,臧國慶,湯正好.  中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志. 2010(05)



本文編號：3664375